| Project/Area Number |
22K19488
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 52:General internal medicine and related fields
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| Research Institution | Hamamatsu University School of Medicine |
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Principal Investigator |
才津 浩智 浜松医科大学, 医学部, 教授 (40402838)
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| Project Period (FY) |
2022-06-30 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,470,000 (Direct Cost: ¥1,900,000、Indirect Cost: ¥570,000)
Fiscal Year 2022: ¥3,900,000 (Direct Cost: ¥3,000,000、Indirect Cost: ¥900,000)
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| Keywords | ハイスループットスクリーニング / 次世代シークエンス / ミスセンス変異体 |
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| Outline of Research at the Start |
網羅的変異タンパク質安定性解析という新たな研究スキームの確立を目指して、下記の研究項目を推進する。
(1)GFP融合ランダム変異体のハイスループット表現型スクリーニング: 変異体の細胞発現とフローサイトメーターによる蛍光強度を指標としたタンパク質安定性評価と細胞分取
(2)次世代シークエンスによる変異体の配列決定: ショートリードとロングリードシークエンスの利点を生かした、多数の変異体のコーディング領域全長の配列決定
(3)無～低発現変異体の発現実験での確認と既知バリアントデータとの相関の検証: 実験系の感度と特異度を、細胞での発現実験と既知バリアントデータから検証
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| Outline of Annual Research Achievements |
GFP融合ランダム変異体のハイスループット表現型スクリーニング
1．ポジティブコントロールを用いたフローサイトメトリーの条件検討
野生型のGFP-STXBP1を発現する発現ベクターと顕著な不安定性を有するGFP-STXBP1-Y84D変異体を発現するベクターを用いて、フローサイトメトリーで分取可能か条件検討を行った。別々にトランスフェクションし、その細胞を混ぜてフローサイトメトリーを行ったところ、内部発現コントロールのDsRedが陽性で、GFPが陰性である細胞（Y84D群）を明瞭に分取可能であった。しかしながら、2つのプラスミドを同時にトランスフェクションした場合、同一細胞に同時にトランスフェクションされるため、内部発現コントロールのDsRedが陽性で、GFPが陰性である細胞（Y84D群）が認められないという結果が得られた。この結果から、トランスフェクションは各クローン別々に行う必要があると考えられた。スループットを上げるために、各クローンのミニプレップは96サンプル処理が可能なキットを用いて行い、各クローンのGFP-STXBP1の発現量を評価後に、抽出したDNAを混合して配列決定を行うこととした。その際には、計画したショートリードとロングリードシークエンスの利点を生かした変異体の配列決定が可能である。
2．変異体発現ベクターライブラリの作製
計画通り、Diversify PCRランダム突然変異誘発キット（タカラバイオ）を用いてランダム変異導入を行った。どの程度の変異が入るかの確認を含めて、まず20クローンを単離し、このクローンをトランスフェクションしてGFP蛍光で安定性が評価できることを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初計画していた発現ベクターライブラリとして多クローンの混合状態でプラスミドDNAを抽出してトランスフェクションを行う方法では、個々のクローンだけが挿入された細胞を分取するのが困難であることがわかり、計画変更を余儀なくされている。
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| Strategy for Future Research Activity |
ランダム変異体を作成し、個々のクローンのDNAを入手する際には、96サンプル処理が可能なキットを用いてスループットを上げる。ここの細胞のGFP-STXBP1の発現量の評価は、フローサイトメトリーではなく、プレートリーダーで行うことで、スループットを上げる。
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