「自己」から逸脱し始めた老化細胞への免疫応答はＰＤ－１によって抑制されるのか？

Research Project

Project/Area Number	22K19508
Research Category	Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
Allocation Type	Multi-year Fund
Review Section	Medium-sized Section 52:General internal medicine and related fields
Research Institution	Nara Institute of Science and Technology
Principal Investigator	石田靖雅奈良先端科学技術大学院大学, 先端科学技術研究科, 准教授 (10221756)
Project Period (FY)	2022-06-30 – 2024-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2022)
Budget Amount *help	¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000) Fiscal Year 2023: ¥3,510,000 (Direct Cost: ¥2,700,000、Indirect Cost: ¥810,000) Fiscal Year 2022: ¥2,990,000 (Direct Cost: ¥2,300,000、Indirect Cost: ¥690,000)
Keywords	PD-1 / aging / neoantigen / T-cell exhaustion / parabiosis / autoimmunity / 獲得免疫 / 自己と非自己の識別 / 細胞老化
Outline of Research at the Start	PD-1 は抗原で刺激された T リンパ球などの細胞表面に発現される分子であり、免疫応答を負に制御する。マウスから PD-1 を除去すると、生後約１年頃から自己免疫病態が出現し始める。しかし、若いマウスに自己免疫病態が出現することはなく、生体では PD-1 がどのような免疫応答を負に制御するのか、明らかではない。申請者は、加齢とともに正常細胞が生み出す変異タンパク質を新しい「自己」として再定義するために、我々動物は進化の過程で PD-1 を獲得した、という仮説を提唱する。本研究の遂行により、我々の免疫系が、老化した正常細胞を「非自己」として誤認識することを回避するための分子機構が明らかになる。
Outline of Annual Research Achievements	（1）生後 21 月齢の老化 C57BL/6 マウスに、機能阻害型 PD-1 抗体（clone 4H2; Melinda, B.L. et al. Clin. Cancer Res. 15, 1623-1634, 2009. ラットで作製した抗マウス PD-1 モノクローナル抗体の定常領域を、遺伝子組換えによってマウス IgG1 の Fc + Ckappa部分に置き換えたもの）を投与した。若齢時に定義された「自己」から逸脱し始めた老化細胞に対する免疫応答を PD-1 が抑制しているならば、PD-1 抗体の投与により、老化マウスには何らかの自己免疫病態が引き起こされる可能性が高いと期待された。それに対し、生後 2~3 月の若齢マウスに同抗体を投与した場合には、自己免疫病態は引き起こされないと考えられた。実験結果は、予想通りのものであった。（2）生後 21 月齢の老化 C57BL/6 マウスと、生後 2~3 月の若齢 PD-1 KO マウスを parabiosis（並体結合）によって連結した。老化マウスがゲノム変異由来のネオ抗原を多数発現しているならば、若齢マウスに由来する T 細胞が老化マウスの体内でそれらを認識して活性化され、特に PD-1 による抑制が働かない場合には、何らかの免疫異常が引き起こされる可能性が高いと考えられた。それに対し、生後 21 月齢の老化 WT マウスと若齢 WT マウスを parabiosis によって連結した場合には、たとえ老化マウスのネオ抗原を若齢マウスに由来する T 細胞が認識した場合でも、その応答は PD-1 によって抑制されてしまうと考えられた。実験結果は、予想通りのものであった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason （1）生後 21 月齢の老化 C57BL/6 マウスに、機能阻害型 PD-1 抗体（clone 4H2; Melinda, B.L. et al. Clin. Cancer Res. 15, 1623-1634, 2009. ラットで作製した抗マウス PD-1 モノクローナル抗体の定常領域を、遺伝子組換えによってマウス IgG1 の Fc + Ckappa部分に置き換えたもの）を投与した。若齢時に定義された「自己」から逸脱し始めた老化細胞に対する免疫応答を PD-1 が抑制しているならば、PD-1 抗体の投与により、老化マウスには何らかの自己免疫病態が引き起こされる可能性が高いと期待された。それに対し、生後 2~3 月の若齢マウスに同抗体を投与した場合には、自己免疫病態は引き起こされないと考えられた。実験結果は、予想通りのものであった。（2）生後 21 月齢の老化 C57BL/6 マウスと、生後 2~3 月の若齢 PD-1 KO マウスを parabiosis（並体結合）によって連結した。老化マウスがゲノム変異由来のネオ抗原を多数発現しているならば、若齢マウスに由来する T 細胞が老化マウスの体内でそれらを認識して活性化され、特に PD-1 による抑制が働かない場合には、何らかの免疫異常が引き起こされる可能性が高いと考えられた。それに対し、生後 21 月齢の老化 WT マウスと若齢 WT マウスを parabiosis によって連結した場合には、たとえ老化マウスのネオ抗原を若齢マウスに由来する T 細胞が認識した場合でも、その応答は PD-1 によって抑制されてしまうと考えられた。実験結果は、予想通りのものであった。これらの研究は当初から予定していたものであるため、研究はおおむね順調に進展していると結論づけることができる。
Strategy for Future Research Activity	（1）生後 21 月齢の老化 C57BL/6 マウスに、機能阻害型 PD-1 抗体（clone 4H2）を投与した際、主に肝臓でリンパ球浸潤のフォーカスが多数観察された。今後は、浸潤するリンパ球を免疫組織化学的に解析し、どのようなリンパ球がどのような割合で浸潤しているかを解析する。また、リンパ球以外にも、マクロファージなどの浸潤が観察されるかどうかを解析する。（2）生後 21 月齢の老化 C57BL/6 マウスと、生後 2~3 月の若齢 PD-1 KO マウスを parabiosis（並体結合）によって連結したところ、老化マウスの主に肝臓と腎臓で、リンパ球浸潤のフォーカスが多数観察された。今後は、浸潤するリンパ球を免疫組織化学的に解析し、どのようなリンパ球がどのような割合で浸潤しているかを解析する。また、リンパ球以外にも、マクロファージなどの浸潤が観察されるかどうかを解析する。また、parabiosis 実験に用いる二匹のマウスの血液細胞を、CD45 のアロタイプ（CD45.1 or CD45.2）で区別し、PD-1 KO マウスに由来する血液細胞が、老化マウスの肝臓や腎臓に浸潤しているかどうかを解析する。（3）当初予定していた臓器移植実験を行う。（4）当初予定していたゲノム解析を行い、老化マウスの体細胞に蓄積したゲノム変異の量（頻度）を大まかに解析する。