Analysis of heterogenous character of neural crest-derived osteoblasts
| Project/Area Number |
22K19613
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 57:Oral science and related fields
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| Research Institution | Tokyo Medical and Dental University |
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Principal Investigator |
井関 祥子 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 教授 (80251544)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
武智 正樹 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 非常勤講師 (10455355)
足立 礼孝 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 助教 (10631533)
中浜 健一 東京医科歯科大学, 大学院医歯学総合研究科, 准教授 (60281515)
二宮 洋一郎 国立情報学研究所, 大学共同利用機関等の部局等, 特任研究員 (90237777)
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| Project Period (FY) |
2022-06-30 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥6,240,000 (Direct Cost: ¥4,800,000、Indirect Cost: ¥1,440,000)
Fiscal Year 2023: ¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000)
Fiscal Year 2022: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000)
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| Keywords | 神経堤 / 中胚葉 / 頭蓋骨 / 骨芽細胞 / heterogeneity |
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| Outline of Research at the Start |
マウスを用いてin vivoおよびin vitroでの神経堤由来および中胚葉由来細胞について、細胞内の多くの生物学的過程を制御するcAMPの細胞内濃度変化を指標とし、両者のheterogeneityを含めた違いについて理解する。
これらの結果に基づいて適切なタイムポイントで、神経堤細胞と中胚葉細胞のシングルセルRNA-seq解析を行う。それぞれの細胞を標識するトランスジェニックマウスを用いてソーティングした細胞で行う。
これにより、神経堤細胞のheterogeneityと骨芽細胞分化優位性との関連、およびこのheterogeneityの発生過程での構築などについて明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
神経堤細胞由来の前頭骨骨芽細胞(FOB)は中胚葉由来の頭頂骨骨芽細胞(POB)に比べて高い骨形成能力を有することが知られている。予備実験から、in vitroにおいて骨芽細胞を活性化させるホルモンであるPTHに対する反応性がFOBの方が高く、さらにその応答性に多様性があることが示された。
今回、FOBとPOBの遺伝子発現に基づいた特徴的な違いを見出すために、双方における遺伝子発現を解析した。また、各組織からのより厳密な細胞分離法を検討した。頭蓋骨という石灰化した硬い組織から遺伝子解析のための十分な数の細胞分離は現実的ではないため、分離した細胞を短期間培養下で増殖させ、それぞれ初代頭蓋骨由来細胞(FOBおよびPOB)としてRNAシークエンス解析を行った。生後3日齢のマウスの頭蓋冠骨を採取して、頭蓋骨周辺組織である骨膜、硬膜、縫合部を完全に除去し、得られた純粋な骨組織をさらに前頭骨部と頭頂骨部に分離して細胞を採取した。得られたFOB及びPOBは形態や増殖能において差を有し、それぞれに独自の特徴を示した。遺伝子発現解析の結果、FOBとPOBは両方とも骨芽細胞に特徴的な遺伝子発現を示していたが、FOBの方が骨形成関連因子やPTH受容体の発現が高くin vitro 及びin vivoにおけるFOBの骨形成能の高さを裏付ける結果であった。一方で、POBにおいては軟骨形成関連遺伝子の発現が高く、POBはin vitroにおける軟骨細胞分化誘導にも反応が強く、軟骨結節を形成する様子が観察された。FOBとPOBでは、それぞれTGF-βとBMPシグナルに関与する受容体の発現が異なって上昇しており、双方の差につながると考えられるが、その上流に関しては今後の課題である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究開始当初は、頭蓋冠骨における神経堤細胞と中胚葉由来の骨芽細胞の違いに関して、特に神経堤細胞における多様性に着目して解析を計画していた。まず、この1年間における研究結果から、神経堤細胞由来の前頭骨と中胚葉由来の頭頂骨の骨芽細胞(FOBとPOB)の特徴の違いとそれに関連するシグナルが明確になりつつあり、期待以上の成果があったと考えられる。一方で、神経堤細胞由来の骨芽細胞に見られる不均一性に関しても、今回の解析結果から手掛かりが見出せている。特にPTHに対する反応においてFOBは不均一性を示したが、PTH受容体の発現がFOBにおいて高く、反応性が高い細胞が存在することを示す。同様に他の生理活性因子関連の遺伝子発現を確認し、FOBとPOBの間に差があるものに関して、細胞の応答性に不均一性があるのかをin vivoとin vitroにおいて確認することが可能である。沢山存在する生理活性因子の中から遺伝子発現解析の結果からFOBとPOBに特異的なcAMPを介する分子を特定することが可能である。
頭蓋間骨の周囲には他の組織も隣接しており複雑に入り組む。今回は細胞分離技術の確立に関しても厳密に条件検討を行い、得られる細胞の純度を上げることに成功している。これまで、国外の研究チームからも同様に前頭骨と頭頂骨の骨芽細胞分離を試みた報告はあるが、今回のような差が報告された例は存在しない。よって、今回の成果は技術確立の面でも大きな進歩があったと考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、PTH以外の生理活性因子に対する応答性もGloSensorマウスを用いた解析によって調べる。成長因子やその受容体などの中からFOBとPOBに関するRNAシークエンスの結果から特にFOBにおいて発現が高いものを作用させて、in vivoおよびin vitroの両方でcAMPの活性を検討し、細胞の応答性に不均一性が見られるか検討する。さらにin vitroで見られた不均一な反応が、in vivoにおける分布とどのように関連しているのか調べる。
また、この研究課題を発展的に展開するため、今回得られたFOBとPOBが持つ特徴をin vivoにおいても精査する。まずはFOB とPOBにおいて発現に差が認められた遺伝子に関して、生後の頭蓋部を含む組織切片を用いてin situハイブリダイゼーションを行い、実際に前頭骨と頭頂骨において差が出るのかどうかを確認する。またこの差が頭蓋冠形成過程でどのように確立されるのかにも着目する。生後３日においてはすでにそれぞれの部位の骨芽細胞の特徴が確立されているので、まだ頭蓋冠骨ができる前の胎生期の予定前頭骨および頭頂骨の形成領域から組織もしくは細胞を採取し、遺伝子発現解析やATACシークエンスなどを試みることで、組織形成中の細胞動態に着目して検討する。
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Report
(1 results)
Research Products
(2 results)
