| Project/Area Number |
22K19852
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Review Section |
Medium-sized Section 63:Environmental analyses and evaluation and related fields
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| Research Institution | St. Marianna University School of Medicine |
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Principal Investigator |
廣井 朋子 聖マリアンナ医科大学, 医学研究科, 講師 (20238398)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大滝 正訓 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 助教 (20612683)
那和 雪乃 聖マリアンナ医科大学, 医学研究科, 助教 (10549786)
立浪 忍 聖マリアンナ医科大学, 医学部, 講師 (70197383)
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| Project Period (FY) |
2022-06-30 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥6,240,000 (Direct Cost: ¥4,800,000、Indirect Cost: ¥1,440,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,210,000 (Direct Cost: ¥1,700,000、Indirect Cost: ¥510,000)
Fiscal Year 2022: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000)
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| Keywords | リアルタイムRT-PCR / DNAトランスフェクション / ハウスキーピング遺伝子 / 内部被ばく / 放射線影響 / リアルタイムPCR |
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| Outline of Research at the Start |
低エネルギーの放射線による人体への影響は、放射線以外の原因による影響との区別が難しい。本研究では、細胞を生かしたまま核内に外来のDNAを取り込ませる実験手法を用いて、放射線源をその細胞の遺伝子のごく近くに置く。そこから照射される低エネルギーの放射線によって、細胞の生命維持に必要な「ハウスキーピング遺伝子」の発現量に変化が起きるかどうかを、鋭敏な検出方法であるリアルタイムPCR法にて測定する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
実験に使用しているヒト皮膚培養細胞は2種とも、トランスフェクション時の試薬量によってはハウスキーピング遺伝子の発現量が減少する傾向が見出されてきた。そのため、新たにヒト大腸腺がん細胞Colo320（RIKEN RCB1193、以下Colo）を加えて、トランスフェクション後のリアルタイムRT-PCRによるmRNA定量実験を行った。トランスフェクションするDNA断片はルシフェラーゼレポーターベクターpGL4.10 (Promega)由来のルシフェラーゼ翻訳部分1650bpとし、RIとして[2,8-3H]-dATP(千代田テクノルMT-644）または[α-32P]-dCTP（パーキンエルマーNEG513H）を用いたランダムプライマー標識法により標識した。48時間培養後に、一部を用いて細胞分画を行い、核および細胞質画分に含まれるRIの量を計測し、残りの細胞より全RNAを抽出した。全RNA 10 ngを鋳型としてRT-PCRを行い、15種類のハウスキーピング遺伝子発現量を定量した。
皮膚細胞および大腸細胞の実際のサイズより、計算に用いるモデル細胞のサイズを策定した。これを用いて、細胞外の培地中にあるRIから細胞全体が受けるエネルギー、細胞質に入ったRIから細胞全体が受けるエネルギー、核内に入ったRIから細胞全体が受けるエネルギーの3つに分けてシミュレーションを行い、3つを足して細胞全体が受けたエネルギーとして計算した。
3Hはβ線エネルギーは低いが、飛程が培養細胞のサイズと同程度であるため、そのエネルギーが細胞内へ効率よく付与される。エネルギーが高く飛程が長い32Pでは、細胞をすぐに通過してしまうため、細胞内に付与するエネルギーの割合は、飛程が短い3Hよりも少ないという計算結果であった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画では3H,14C,32P,35S,125Iという多種の放射性核種を用いて実験を行う予定であったが、円安などの情勢による値上がりのため、予定していた額では購入できなくなり、まだ3Hと32Pでしか実験できていない。一方、β線エネルギーが高い32Pよりも、エネルギーが低く飛程が短い3Hの方が、細胞に付与されるエネルギーが大きいという計算結果が得られ、より透過力が強いガンマ線核種で同様の実験を行っても、観察しうるほどのmRNA量の変動は起きない可能性が高いと予測された。そのため、他の核種による実験は行わず、3Hに的を絞って成果をまとめようと考え、「おおむね順調」とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
mRNAの発現量の変動はリアルタイムRT-PCRにより鋭敏に検出できるが、鋭敏であるが故に目的とした条件以外の環境要因による変動も検出されるため、目的とした「添加したRIから細胞が吸収したエネルギー」を原因とする変動であるかどうかは、実験の例数を増やし、統計的に検証する必要がある。
2024年度は、すでに抽出し蓄積しててきたRNAを鋳型としたRT-PCRを繰り返して、データ数を増やすことと共に、トランスフェクションの条件を厳密に統一した状態でのトランスフェクション実験を新たに行い、mRNA発現量の変動が添加したRIに起因するものであることをより明確に検証できるデータを揃えることを目標とする。
また、β線エネルギーが高い32Pよりも、エネルギーが低く飛程が短い3Hの方が、細胞に付与されるエネルギーが大きいという計算結果より、他の核種による実験は行わず、3Hに的を絞って成果をまとめる。細胞モデルによるエネルギー計算と、RT-PCRによるmRNA発現量の変動の検出に分けて、論文を執筆すること、および学術大会で口頭発表すること、を目標とする。
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