Development of artificial exosomes containing proteins toward cancer genome editing

Research Project

Project/Area Number	22K19920
Research Category	Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
Allocation Type	Multi-year Fund
Review Section	Medium-sized Section 90:Biomedical engineering and related fields
Research Institution	Nagasaki University
Principal Investigator	麓伸太郎長崎大学, 医歯薬学総合研究科(薬学系), 准教授 (70380988)
Project Period (FY)	2023-03-27 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥6,500,000 (Direct Cost: ¥5,000,000、Indirect Cost: ¥1,500,000) Fiscal Year 2023: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000) Fiscal Year 2022: ¥3,250,000 (Direct Cost: ¥2,500,000、Indirect Cost: ¥750,000)
Keywords	ドラッグデリバリーシステム / エクソソーム / 脂質ナノ粒子 / ゲノム編集
Outline of Research at the Start	ゲノム編集は、人為的に細胞の設計図であるゲノムを編集する技術です。がんの治療において、がん細胞のゲノムを編集できれば新たな治療法となることが期待されます。がん細胞のゲノムを編集するためには、Cas9というタンパク質と鋳型であるガイドRNAを目標である癌細胞に運搬する必要があります。本研究では、エクソソームという天然の運搬体を人工的に再現した人工エクソソームを開発し、がん細胞のゲノムを編集する技術の基盤とします。
Outline of Annual Research Achievements	エクソソームは効率的な天然のデリバリーキャリアとして期待されている。しかし細胞から分泌されるエクソソームは、不均一で精製するのは容易ではなく、微量で大量精製法も未確立である。本研究では、均質で大量生産可能な人工エクソソーム製造法を開発する。エクソソームには、核酸やタンパク質が内包されている。これまでに代表者は、アルコール注入法を基盤にエクソソームの脂質組成からなる脂質ナノ粒子を調製し、プロタミン硫酸を利用してプラスミドDNAを搭載したエクソソーム模倣脂質ナノ粒子により高い遺伝子発現効率を得ている。本研究ではタンパク質をエクソソーム模倣脂質ナノ粒子に搭載することで人工エクソソームと呼べる核酸・タンパク質デリバリーキャリアを開発することを目的とした。まず、プラスミドDNAと同様にプロタミン硫酸を用いて、モデルタンパク質であるウシ血清アルブミンを用いて、エクソソームの脂質組成の粒子に内包できるかどうかを検討したが、うまく行かなかった。代表者は、一方でカチオン性脂質・タンパク質・炭酸カルシウムからなるナノ粒子の調製に成功している。エクソソームの脂質はアニオン性および中性脂質からなるが、炭酸カルシウムを用いることで、アルブミンをテンプレートにして炭酸カルシウムコアを形成させ、ナノ粒子に内包できるのではないかと想起した。実際に検討したところ、粒子径100 nm程度、PDI 0.2程度のアルブミン搭載人工エクソソームを調製できた。電気泳動によりアルブミンが内包されることも確認した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 計画とは異なるが、炭酸カルシウムコアを形成される戦略でエクソソームの脂質組成のナノ粒子にモデルタンパク質アルブミンを内包することができたため。
Strategy for Future Research Activity	2年度目では、モデルタンパク質アルブミンの代わりにCas9とガイドRNAからなるRNPを内包した人工エクソソームを調製し、ゲノム編集効率を評価する。