SP-1賦活化歯肉幹細胞由来エクソソームによるアデノシン代謝を標的とした炎症制御

• Project/Area Number: 22K21041
• Research Category: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: 0907:Oral science and related fields
• Research Institution: Kyushu University
• Principal Investigator: 渡邊 ゆかり 九州大学, 大学病院, 医員 (30961924)
• Project Period (FY): 2022-08-31 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000); Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
• Keywords: 歯肉幹細胞 / エクソソーム / SP-1 / アデノシン / マクロファージ / 炎症制御

Outline of Research at the Start

間葉系幹細胞（MSC）はその多分化能により再生目的組織の機能を代替するだけでなく、障害を受けた組織の再生を分泌物質により強力にサポートすることで治療効果を発揮するとした概念が提唱され、その活性中心を担う分泌物としてエクソソームが注目されている。

本研究は、歯肉幹細胞への転写因子SP-1活性化によるエクソソーム細胞膜酵素CD39/CD73発現亢進を介して、効率的な修復性マクロファージ誘導増強効果を得ることを目的としている。新規歯周病治療の開発のみならず、 歯肉幹細胞由来エクソソームによる慢性炎症性疾患への応用に向けた基盤を構築することで、更なる波及効果が期待される。

Outline of Annual Research Achievements

慢性炎症疾患である歯周炎の発症・進行と創傷治癒には、歯周組織に浸潤したマクロファージの機能が深く関わっている。マクロファージはその働きにより、炎症型（M1）および炎症の収束と組織再生を担う修復型（M2）の2種類に大別される。歯周組織破壊には主に炎症性（M1）マクロファージが関与する一方で、歯周組織再生の成功には、修復型（M2）マクロファージの誘導が不可欠であるとされる.
申請者のグループは先行研究で、歯肉幹細胞(GMSC)由来エクソソームによる修復型(M2)マクロファージ誘導を介した歯周炎抑制効果を報告した。一方、M2マクロファージはアデノシン三リン酸（ATP）から細胞膜酵素CD39/CD73の働きで産生されるアデノシンにより誘導される。近年、幹細胞を炎症刺激することによるネガティブフィードバック機構により、その抗炎症能が増強することが報告されている。そこで申請者が検証を行った結果、TNF-α/IFN-αによる共刺激が最もエクソソームでのCD73発現を誘導することを確認し、TNF-α/IFN-α共刺激GMSC由来エクソソームは含有CD73/CD5Lの促進を介して相乗的にM2マクロファージ誘導能を増強することを発見した。
さらに、転写因子であるSP-1がCD39/CD73両分子の発現制御を行うことに着目し、GMSCへのSP-1活性化によるエクソソーム含有CD39/CD73発現亢進を介して、更に効率的なM2マクロファージ誘導増強効果を得ることを目的として研究を進めている。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

GMSCへのTNF-α/IFN-α共刺激GMSC由来エクソソームが、含有CD73/CD5Lの促進を介して相乗的にM2マクロファージ誘導能を増強することを論文発表したが、リバイス実験対応に時間を費やしたため。

Strategy for Future Research Activity

SP-1による GMSC 由来エクソソームのCD39/CD73発現制御を介したM2マクロファージ誘導について以下の方法で検証する。
①SP-1によるGMSCエクソソーム内包CD39/CD73発現制御機構の解析
予備実験の結果から、TNF-α/IFN-α刺激でSP-1/SMAD5発現が亢進することによりGMSC由来エクソソーム内包CD73の発現促進を確認している。CD39に対してSP-1が促進因子であり、SMADが抑制因子であることから、SP-1発現Plasmid導入によるCD39/CD73発現が誘導されるかを検証する。上手くいかない場合、GMSCへのSMAD5-siRNAもしくはCD39/CD73発Plasmid導入によるエクソソーム内包CD39/CD73発現促進を試みる。
②SP-1過剰発現GMSC由来エクソソームによるM2マクロファージ誘導能とアデノシン代謝の評価
SP-1過剰発現GMSC由来エクソソーム刺激によるM2型マクロファージ誘導能について、qRT-PCRおよびフローサイトメトリーでM1マーカー（CD86）/M2マーカー（CD206）の発現を比較する。細胞はTHP-1もしくはCD14+末梢血単球からの分化マクロファアージを使用する。さらにエクソソーム添加時の細胞内および培養液内のATP量、アデノシン量を測定し、アデノシン代謝が活性化されていることを確認する。

Research Products

• [Journal Article] Extracellular vesicles derived from GMSCs stimulated with TNF-α and IFN-α promote M2 macrophage polarization via enhanced CD73 and CD5L expression. (2022)
  • Author(s): Watanabe Y, Fukuda T, Hayashi C, Nakao Y, Toyoda M, Kawakami K, Shinjo T, Iwashita M, Yamato H, Yotsumoto K, Taketomi T, Uchiumi T, Sanui T, Nishimura F.
  • Journal Title: Sci Rep Volume: 12(1) Issue: 1 Pages: 13344-13344
  • DOI: 10.1038/s41598-022-17692-0
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] miR-1260b inhibits periodontal bone loss by targeting ATF6β mediated regulation of ER stress. (2022)
  • Author(s): Hayashi C, Fukuda T, Kawakami K, Toyoda M, Nakao Y, Watanabe Y, Shinjo T, Sano T, Iwashita M, Yotsumoto K, Shida M, Taketomi T, Sanui T, Uchiumi T, Kanematsu T, Nishimura F.
  • Journal Title: Front Cell Dev Biol Volume: 10 Pages: 1061216-1061216
  • DOI: 10.3389/fcell.2022.1061216
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] TNF-α/IFN-α共刺激した歯肉幹細胞由来エクソソームはCD73とCD5Lを介して抗炎症性M2マクロファージを誘導する (2022)
  • Author(s): 渡邊ゆかり、林千華子、川上賢太郎、豊田真顕、中尾雄紀、大和寛明、四本かれん、新城尊徳、岩下未咲、讃井彰一、福田隆男、西村英紀
  • Organizer: 第156回日本歯科保存学会2022年度春季学術大会
• [Presentation] ヒト歯髄細胞由来マイクロベジクル含有PKRを標的とした歯髄鎮静薬および歯内・歯周病変モデルの作成に向けて (2022)
  • Author(s): 川上賢太郎、渡邊ゆかり、林千華子、豊田真顕、新城尊徳、讃井彰一、福田隆男、西村英紀
  • Organizer: 第156回日本歯科保存学会2022年度春季学術大会
• [Presentation] 歯肉幹細胞由来エクソソーム内包miR-1260bによる小胞体ストレス応答制御を介した歯周炎骨吸収抑制効果 (2022)
  • Author(s): 林千華子、福田隆男、渡邊ゆかり、川上賢太郎、豊田真顕、中尾雄紀、四本かれん、大和寛明、新城尊徳、讃井彰一、西村英紀
  • Organizer: 第65回春季日本歯周病学会学術大会
• [Presentation] バイオ3Dプリンターを用いた、間葉系幹細胞からの骨様立法構造物作製への挑戦 (2022)
  • Author(s): 豊田真顕、梶岡俊一 、福田隆男 、渡辺ゆかり 、林千華子 、川上賢太郎 、中尾雄紀、四本かれん 、大和寛明 、讃井彰一 、西村英紀
  • Organizer: 第65回春季日本歯周病学会学術大会
• [Presentation] miR-1260b inhibits periodontal bone loss by targeting ATF6β (2022)
  • Author(s): Hayashi C, Kawakami K, Toyoda M, Watanabe Y, Nakao Y, Yotsumoto K, Yamato H, Shinjo T, Sanui T, Fukuda T, Nishimura F.
  • Organizer: The 108th Annual Meeting of the American Academy of Periodontology（国際学会）
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Fabrication of stem cell-based scaffold-free bone-like 3D structures. (2022)
  • Author(s): Toyoda M, Kajioka S, Fujimoto R, Hayashi C, Kawakami K, Watanabe Y, Nakao Y, Yotsumoto K, Sanui T, Fukuda T, Nakayama K, Nishimura. F.
  • Organizer: The 108th Annual Meeting of the American Academy of Periodontology（国際学会）
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] バイオ３Dプリンターを用いた、間葉系幹細胞からの骨様立法構造物作製への挑戦 (2022)
  • Author(s): 豊田真顕、梶岡俊一 、川上賢太郎 、林千華子 、渡邊ゆかり 、中尾雄紀 、四本かれん 、讃井彰一 、福田隆男 、西村英紀
  • Organizer: 令和4年度日本歯周病学会九州五大学 日本臨床歯周病学会九州支部合同研究会
• [Presentation] ヒト歯髄細胞由来マイクロベジクル含有PKRを標的とした歯髄鎮静薬および歯内・歯周病変モデルの作成に向けて (2022)
  • Author(s): 川上賢太郎、渡邊ゆかり、林千華子、豊田真顕、新城尊徳、讃井彰一、福田隆男、西村英紀 ヒ川上賢太郎、渡邊ゆかり、林千華子、豊田 真顕、新城尊徳、讃井彰一、福田隆男、西村英紀
  • Organizer: 第157回日本歯科保存学会2022年度秋季学術大会