歯周病原細菌P.gingivalisの線毛における新たな遺伝子型解析
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22K21050
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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0907:Oral science and related fields
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| Research Institution | Aichi Gakuin University |
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Principal Investigator |
榮 宏太朗 愛知学院大学, 歯学部, 歯学部研究員 (60962818)
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| Project Period (FY) |
2022-08-31 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
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| Budget Amount *help |
¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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| Keywords | Porphyromonas gingivalis / 歯周病原細菌 / FimA線毛・Mfa1線毛 / プライマー設計 / 相同性解析 / 遺伝子型分類 / バイオフィルム |
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| Outline of Research at the Start |
本研究では、歯周病患者の歯肉縁下プラーク(バイオフィルム)から歯周病の代表的な原因細菌として知られているPorphyromonas gingivalisを歯科用器具で採取し、歯周病の重症度との関連を調査する。
そして、P.gingivalisの付着因子であるFimA線毛及びバイオフィルム形成の調節に関わっていることが報告されているMfa1線毛の線毛遺伝子群の遺伝子型分類を行い、全ての線毛因子の遺伝子型を決定し、臨床症状と線毛型との関連を統計学的に解析する。
さらに、異なる遺伝子型における線毛機能解析に発展させ、mfa1遺伝子型間でのバイオフィルム形成能を比較する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
グラム陰性偏性嫌気性桿菌Porphyromonas gingivalisは歯周病の代表的な原因細菌として知られている。本菌は付着因子としてFimA及びMfa1線毛を持つ。これらの線毛は主要成分であるFimA及びMfa1タンパク質により構成されるが、その他にそれぞれ4つの微量成分FimB～FimE及びMfa2～Mfa5が含まれる。fimAはその遺伝子配列の違いによってgenotypeI～V型に分類されるが、fimA型と病原性との関連性については不明な点が多い。
一方、mfa1のgenotypeについては解析が進んでいなかったが、近年我々は mfa1が53、70A及び70B型に分類されることを明らかにし、微量成分の遺伝子型解析にも着手し、mfa2～mfa5及びfimB～fimEにおいても異なる遺伝子型が存在することも報告した。
本研究では、P. gingivalisの全ての線毛成分の遺伝子型分類を可能とする手法を確立すると共に、開発した方法により歯周炎患者のFimA線毛及びMfa1線毛の遺伝子型分類を試み、臨床症状との関連性を調査することを目的とした。現在までに、既報のプライマー及び新規に設計したプライマーを用いて主要成分fimA及びmfa1のPCRを実施した。新規に設計したプライマーではそれぞれのmfa1型が特異的に増幅されることが確認された。
第64回歯科基礎医学会学術大会にて「Porphyromonas gingivalisのmfa1下流因子の遺伝子型解析」という題で発表を行った。(1)mfa2～mfa4は70と53型の遺伝子型に分られ、それらの遺伝子型はmfa1型と一致した。ただし、70型のサブタイプは認められなかった。(2)一方、mfa5はA～Eの遺伝子型に分類され、mfa5がタンデムに存在する株が認められた。(3)mfa1型は、ragA/ragB遺伝子型と相関する傾向が認められたが、mfa5型との相関は認められなかった。との研究結果を報告し、mfa1型とmfa2～mfa5型、およびragA/ragB型との関連性について発表した。
現在、臨床サンプルを用いた研究をスタートするために倫理委員会申請等の準備をすすめている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
歯周炎患者のP. gingivalisのFimA線毛及びMfa1線毛の遺伝子型分類のため、fimA(I～V型)及び、mfa1(53,70A,70B)のForwardプライマー及びReverseプライマーを設計し、PCR及び電気泳動を行い線毛遺伝子がそれぞれ増幅されていることを確認した。その際、異なる遺伝子型の線毛成分が増幅されることがないようDNA相同性解析をし、PCR条件に適したプライマーを設計した。また、解析に適した電気泳動用ゲルの製作、マーカーの選択を行った。
また、2022年度徳島大学にて行われた第64回歯科基礎医学会学術大会にて「Porphyromonas gingivalisのmfa1下流因子の遺伝子型解析」という題で発表を行った。(1)mfa2～mfa4は70と53型の２つ遺伝子型に分られ、それらの遺伝子型はmfa1型と一致した。ただし、70型のサブタイプは認められなかった。(2)一方、mfa5は、他の遺伝子型とは独立し、Ａ～Eの5つの遺伝子型に分類され、mfa5がタンデムに存在する株が認められた。(3)mfa1型は、ragA/ragB遺伝子型と相関する傾向が認められたが、mfa5型との相関は認められなかった。以上のことから、Mfa1線毛の遺伝子型と病原性との関連の解析には、mfa1型だけではなく、線毛の微量成分や下流因子の多型との関連性について検討する必要があると考えられるとの研究結果を発表した。
現在、臨床サンプルを用いた研究をスタートするために倫理委員会申請等の準備をすすめている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後、臨床サンプルを用いた研究に移行するため、歯周病患者から縁下プラークを採取し線毛遺伝子群の遺伝子型分類を行い、歯周病の重症度（ポケット深さ、出血の有無、PISA、PESA等）との関連を調査する。
具体的には、初診患者について、歯肉縁下プラークサンプルを滅菌ハンドスケーラーで採取し、0.01％ジチオスレイトール含有PBS（pH7.4）1mlに移す。サンプルは直ちに4℃に保存しゲノムを抽出する。得られたゲノムを鋳型として全ての線毛因子の遺伝子型を決定する。最終的には臨床症状と線毛型との関連を統計学的に解析する。
もし研究が順調に進んだ場合は、異なる遺伝子型におけるMfa1線毛機能解析に発展させる。特にMfa1線毛がバイオフィルム形成の調節に関わっていることが報告されていることから、mfa1遺伝子型間でのバイオフィルム形成能を比較する。
令和4年4月より口腔バイオフィルム感染症において口腔細菌定量検査が保険適応となった。口腔細菌の定量解析の重要性が高まっており、特に歯周病検査では、診断や予後の審査において細菌検査はますます重要になると思われる。
そのような中で、既報の研究は、P. gingivalisの病原性を評価するにはfimA型分類のみの解析では不十分であることを示している。今後、今まで見逃されてきたfimB～E及びmfa2～mfa5を含むクラスター全体に範囲を拡げ、遺伝子型分類を行う予定である。
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Report
(1 results)
Research Products
(3 results)
