The molecular basis of dopaminergic transmission: Identifying and Characterizing Cellular Adhesion Sites

Research Project

Project/Area Number	22KF0335
Project/Area Number (Other)	22F22386 (2022)
Research Category	Grant-in-Aid for JSPS Fellows
Allocation Type	Multi-year Fund (2023) Single-year Grants (2022)
Section	外国
Review Section	Basic Section 46010:Neuroscience-general-related
Research Institution	Keio University
Principal Investigator	柚崎通介慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 教授 (40365226)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	DILINA TUERDE 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 外国人特別研究員
Project Period (FY)	2023-03-08 – 2025-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥2,300,000 (Direct Cost: ¥2,300,000) Fiscal Year 2024: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000) Fiscal Year 2023: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000) Fiscal Year 2022: ¥500,000 (Direct Cost: ¥500,000)
Keywords	ドーパミン / シナプス / 側坐核 / 背側被蓋野
Outline of Research at the Start	In the present study, I will investigate how dopaminergic pathways are formed to achieve their neurotransmission, focusing on the VTA-NAc mesolimbic dopaminergic pathway. I will accomplish three specific goals. First, I will characterize synaptic and non-synaptic contact sites along dopaminergic axons. Second, I will identify molecules involved in these contact sites. Finally, I will elucidate how synaptic and non-synaptic contact sites regulate dopaminergic functions. I expect to accomplish these goals and address long-standing questions in the mesolimbic dopaminergic pathway.
Outline of Annual Research Achievements	ドーパミンは、認知・意思・行動に影響を及ぼす神経調節物質である。グルタミン酸やGABAなどの古典的な神経伝達物質は、シナプス小胞や神経伝達物質受容体が集積する「シナプス」を基点として情報伝達が行われる。一方、ドーパミンを含む小胞やドーパミン受容体は集積せず、容量伝達により情報伝達が行われると考えられてきた。しかし、私たちはドーパミン作動性神経線維は、ドーパミン受容体を発現する神経細胞との間に非シナプス性接着構造を形成することを見いだした。本研究では中脳辺縁系経路に焦点を当て、腹側被蓋野（VTA)のドーパミン作動性神経線維と側坐核（NAc)との間に形成される非シナプス性接着構造の分子実体とその機能的意義の解明を目指した。本研究成果は、統合失調症・パーキンソン病・自閉スペクトラム症などの精神神経疾患の理解を進めて、新たな診断・治療手段の開発につながる可能性がある。具体的には、NAcとVTAのそれぞれにN末側半分とC末側半分に分割した緑色蛍光タンパク質（GFP)をグリコシルホスファチジルイノシトールによってそれぞれの神経細胞膜上に発現させることによって、VTA軸索とNAcが物理的に近接する部位で再構成されたGFP蛍光によって可視化する技術（GRAPHIC)を用いることによって、以下の3つの目標を達成する。まず、VTA軸索とNAcが近接する部位を明らかにする。次にこれらの近接部位に局在する分子群を同定する。最後に、シナプスと非シナプスの接触部位がどのようにドパミン作動性機能を制御しているのかを明らかにする。本年度はドーパミン作動性ニューロンにおいてCreリコンビナーゼを発現する遺伝子改変マウスに対して、アデノ随伴ウイルス（AAV）を感染させることによって、VTA-NAcの近接部位をGFP蛍光で可視化することに成功した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 計画通り、ドーパミン作動性ニューロンにおいてCreリコンビナーゼを発現する遺伝子改変マウスに対して、アデノ随伴ウイルス（AAV）を感染させることによって、VTA-NAcの近接部位をGFP蛍光で可視化することに成功した。この技術を用いることによって、ドーパミン作動性軸索に沿ったシナプスおよび非ナプスの接触部位の特徴や、これらの接触部位に関与する分子群の同定が可能になることが期待できる。
Strategy for Future Research Activity	VTA由来のドーパミン軸索とNAcの中型有棘神経細胞の間にはGFP蛍光で可視化される接着部位が存在した。この存在部位について免疫組織化学染色後に超解像顕微鏡観察を行うことによって、ドーパミン受容体やGABA受容体等のシナプス後部分子や、シナプス小胞分子や小胞放出分子群との位置関係を明らかにする。また接着部位の実体については再構成されたGFPに対する抗体を用いた免疫電子顕微鏡法によって明らかにする。近接部位に局在する分子群の機能的意義については、代表的な分子に対してノックダウンすることによって明らかにする。