Establishment of efficient virus isolation by protease expression cells

• Project/Area Number: 22KJ0023
• Project/Area Number (Other): 21J21075 (2021-2022)
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Multi-year Fund (2023); Single-year Grants (2021-2022)
• Section: 国内
• Review Section: Basic Section 58020:Hygiene and public health-related: including laboratory approach
• Research Institution: Osaka Metropolitan University (2023); Hokkaido University (2021-2022)
• Principal Investigator: 岸本 麻衣 大阪公立大学, 大学院獣医学研究科, 助教
• Project Period (FY): 2023-03-08 – 2024-03-31
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥2,200,000 (Direct Cost: ¥2,200,000); Fiscal Year 2023: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000); Fiscal Year 2022: ¥700,000 (Direct Cost: ¥700,000); Fiscal Year 2021: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000)
• Keywords: プロテアーゼ依存性ウイルス / ウイルス分離 / 人獣共通感染症 / ロタウイルスA / 脳心筋炎ウイルス / コウモリ / マストミス

Outline of Research at the Start

近年、メタゲノム解析手法の普及により、様々な検体から膨大な数の新規ウイルスゲノムが検出されている。しかし、そのような新規ウイルスの多くは感染性ウイルス粒子が分離されておらず、病原性等の生物学的性状解析、中和抗体検出による疫学調査等によるリスク評価が困難である。
本研究では、宿主プロテアーゼ依存性ウイルスに着目し、高効率なウイルス分離法を開発する。この方法では、宿主プロテアーゼを恒常発現する細胞株の作成および次世代シークエンサー解析による網羅的な分離ウイルス検出により、ウイルスの分離効率を高める。さらに、開発した手法により多数の野生動物検体からウイルスを分離し、性状解析を実施する。

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、プロテアーゼ依存性ウイルスを主な標的として、宿主プロテアーゼを発現する細胞を用いたウイルス分離と次世代シークエンサーによる網羅的ウイルス検出を組み合わせたスクリーニング系を構築し、ザンビアで採取された野生動物合計約400検体からウイルス分離を実施し、脳心筋炎ウイルスおよびロタウイルスA（RVA）を分離した。
本年度は、コウモリおよび齧歯類動物から分離されたRVAの性状解析を実施した。近年、一部の分節でコウモリや齧歯類由来のRVAと類似した遺伝子型をもつRVAがヒトから検出されており、コウモリと齧歯類動物のRVAの人獣間伝播の可能性が懸念されている。しかし、これらの報告はゲノム解析にとどまるものが多く、ウイルスの分離及び性状解析はほとんど実施されていない。まず、全分節の遺伝子配列情報を決定し、遺伝子再集合の評価、および系統学的解析により、特徴的な進化系統を有することを明らかにした。続いて、RVAが細胞侵入する際の接着因子である細胞表面糖鎖とRVAの結合性を調べた結果、16-06株は細胞表面のシアル酸と結合して細胞内に侵入する一方、MpR12株はシアル酸とは結合しないことが明らかになった。さらに、乳飲みマウスへの経口接種により分離株の病原性を評価した結果、16-06株およびMpR12株はどちらも乳飲みマウスに感染し、下痢を引き起こすことが示された。また、3次元再構築したヒト初代腸管上皮に対するRVAの感染性を調べた結果、16-06株およびMpR12株は、ヒト由来RVA Wa株と同等の効率で感染増殖することが明らかになった。本研究では、特徴的な遺伝学的背景を有するコウモリおよび齧歯類由来RVAのウイルス学的性状を、それらのRVAが人獣共通感染症となる可能性についてさらなる調査が必要であることが示唆された。

Research Products

• [Journal Article] Combination therapy with oral antiviral and anti-inflammatory drugs improves the efficacy of delayed treatment in a COVID-19 hamster model (2024)
  • Author(s): Sasaki M, Sugi T, Iida S, Hirata Y, Kusakabe S, Konishi K, Itakura Y, Tabata K, Kishimoto M, Kobayashi H, Ariizumi T, Intaruck K, Nobori H, Toba S, Sato A, Matsuno K, Yamagishi J, Suzuki T, Hall WW, Orba Y, Sawa H.
  • Journal Title: eBioMedicine Volume: 99 Pages: 104950-104950
  • DOI: 10.1016/j.ebiom.2023.104950
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Comparative pathogenicity of SARS-CoV-2 Omicron subvariants including BA.1, BA.2, and BA.5 (2023)
  • Author(s): Tamura T, Yamasoba D, Oda Y, Ito J, Kamasaki T, Nao N, Hashimoto R, Fujioka Y, Suzuki R, Wang L, Ito H, Kashima Y, Kimura I, Kishimoto M, Tsuda M, Sawa H, Yoshimatsu K, Yamamoto Y, Nagamoto T, Kanamune J, Suzuki Y, Ohba Y, et al.
  • Journal Title: Communications Biology Volume: 6 Issue: 1 Pages: 772-772
  • DOI: 10.1038/s42003-023-05081-w
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Impact of Imprinted Immunity Induced by mRNA Vaccination in an Experimental Animal Model (2023)
  • Author(s): Fujita S, Uriu K, Pan L, Nao N, Tabata K, Kishimoto M, Itakura Y, Sawa H, Kida I, Tamura T; Genotype to Phenotype Japan (G2P-Japan) Consortium; Fukuhara T, Ito J, Matsuno K, Sato K.
  • Journal Title: The Journal of Infectious Diseases Volume: 228 Issue: 8 Pages: 1060-1065
  • DOI: 10.1093/infdis/jiad230
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Development of flavivirus subviral particles with low cross-reactivity by mutations of a distinct antigenic domain (2023)
  • Author(s): Tabata K, Itakura Y, Ariizumi T, Igarashi M, Kobayashi H, Intaruck K, Kishimoto M, Kobayashi S, Hall WW, Sasaki M, Sawa H, Orba Y.
  • Journal Title: Applied Microbiology and Biotechnology Volume: 107 Issue: 24 Pages: 7515-7529
  • DOI: 10.1007/s00253-023-12817-5
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Morphogenesis of bullet-shaped rabies virus particles regulated by TSG101 (2023)
  • Author(s): Yukari Itakura, Koshiro Tabata, Takeshi Saito, Kittiya Intaruck, Nijiho Kawaguchi, Mail Kishimoto, Shiho Torii, Shintaro Kobayashi, Naoto Ito, Michiko, Harada, Satoshi Inoue, Ken Maeda, Ayato Takada, William W. Hall, Yasuko Orba, Hirofumi Sawa, Michihito Sasaki
  • Journal Title: Journal of Virology Volume: － Issue: 5
  • DOI: 10.1128/jvi.00438-23
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Isolation and Characterization of Distinct Rotavirus A in Bat and Rodent Hosts (2023)
  • Author(s): Kishimoto M, Kajihara M, Tabata K, Itakura Y, Toba S, Ozono S, Sato Y, Suzuki T, Ito N, Changula K, Qiu Y, Mori-Kajihara A, Eto Y, Harima H, Mwizabi D, Hang’ombe BM, Hall WW, Takada A, Orba Y, Sawa H, Sasaki M
  • Journal Title: Journal of Virology Volume: 97 Issue: 1
  • DOI: 10.1128/jvi.01455-22
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] S-217622, a SARS-CoV-2 main protease inhibitor, decreases viral load and ameliorates COVID-19 severity in hamsters (2022)
  • Author(s): Michihito Sasaki, Koshiro Tabata, Mai Kishimoto, Yukari Itakura, Hiroko Kobayashi, Takuma Ariizumi, Kentaro Uemura, Shinsuke Toba, Shinji Kusakabe, Yuki Maruyama et al.
  • Journal Title: Science Translational Medicine Volume: 15(679) Issue: 679
  • DOI: 10.1126/scitranslmed.abq4064
  • Peer Reviewed / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Virological characteristics of the SARS-CoV-2 Omicron BA.2 subvariants, including BA.4 and BA.5 (2022)
  • Author(s): Kimura et al.
  • Journal Title: Cell Volume: 185 Issue: 21 Pages: 3992-4007
  • DOI: 10.1016/j.cell.2022.09.018
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Isolation and characterization of an orthoreovirus from Indonesian fruit bats (2022)
  • Author(s): Intaruck Kittiya、Itakura Yukari、Kishimoto Mai、Chambaro Herman M.、Setiyono Agus、Handharyani Ekowati、Uemura Kentaro、Harima Hayato、Taniguchi Satoshi、Saijo Masayuki、Kimura Takashi、Orba Yasuko、Sawa Hirofumi、Sasaki Michihito
  • Journal Title: Virology Volume: 575 Pages: 10-19
  • DOI: 10.1016/j.virol.2022.08.003
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] A comprehensive list of the Bunyavirales replication promoters reveals a unique promoter structure in Nairoviridae differing from other virus families (2022)
  • Author(s): Yutaro Neriya, Shohei Kojima, Arata Sakiyama, Mai Kishimoto, Takao Iketani, Tadashi Watanabe, Yuichi Abe, Hiroshi Shimoda, Keisuke Nakagawa, Takaaki Koma, Yusuke Matsumoto
  • Journal Title: Scientific Reports Volume: 12 Issue: 1 Pages: 13560-13560
  • DOI: 10.1038/s41598-022-17758-z
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Serological characterization of lineage II insect-specific flaviviruses compared with pathogenic mosquito-borne flaviviruses (2022)
  • Author(s): Tabata Koshiro、Itakura Yukari、Toba Shinsuke、Uemura Kentaro、Kishimoto Mai、Sasaki Michihito、Harrison Jessica J.、Sato Akihiko、Hall William W.、Hall Roy A.、Sawa Hirofumi、Orba Yasuko
  • Journal Title: Biochemical and Biophysical Research Communications Volume: 616 Pages: 115-121
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2022.05.080
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Virological characteristics of the SARS-CoV-2 Omicron BA.2 spike (2022)
  • Author(s): Yamasoba Daichi、Kimura Izumi、Nasser Hesham他
  • Journal Title: Cell Volume: 未定 Issue: 12 Pages: 2103-2115
  • DOI: 10.1016/j.cell.2022.04.035
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Attenuated fusogenicity and pathogenicity of SARS-CoV-2 Omicron variant (2022)
  • Author(s): Suzuki Rigel、Yamasoba Daichi、Kimura Izumi、Wang Lei他
  • Journal Title: Nature Volume: 603 Issue: 7902 Pages: 700-705
  • DOI: 10.1038/s41586-022-04462-1
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Mastomys natalensis is a possible natural rodent reservoir for encephalomyocarditis virus (2021)
  • Author(s): Kishimoto M, Hang'ombe BM, Hall WW, Orba Y, Sawa H, Sasaki M.
  • Journal Title: J Gen Virol Volume: 102(3) Issue: 3
  • DOI: 10.1099/jgv.0.001564
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] TMPRSS11D and TMPRSS13 Activate the SARS-CoV-2 Spike Protein (2021)
  • Author(s): Kishimoto M, Uemura K, Sanaki T, Sato A, Hall WW, Kariwa H, Orba Y, Sawa H, Sasaki M.
  • Journal Title: Viruses Volume: 13(3) Issue: 3 Pages: 384-384
  • DOI: 10.3390/v13030384
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Host serine proteases TMPRSS2 and TMPRSS11D mediate proteolytic activation and trypsin-independent infection in group A rotaviruses. (2021)
  • Author(s): Sasaki M, Itakura Y, Kishimoto M, Tabata K, Uemura K, Ito N, Sugiyama M, Wastika CE, Orba Y, Sawa H.
  • Journal Title: J Virol Volume: - Issue: 11
  • DOI: 10.1128/jvi.00398-21
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] SARS-CoV-2 Bearing a Mutation at the S1/S2 Cleavage Site Exhibits Attenuated Virulence and Confers Protective Immunity (2021)
  • Author(s): Sasaki Michihito、Toba Shinsuke、Itakura Yukari、Chambaro Herman M.、Kishimoto Mai、Tabata Koshiro、Intaruck Kittiya、Uemura Kentaro、Sanaki Takao、Sato Akihiko、Hall William W.、Orba Yasuko、Sawa Hirofumi
  • Journal Title: mBio Volume: 12 Issue: 4
  • DOI: 10.1128/mbio.01415-21
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Air-liquid interphase culture confers SARS-CoV-2 susceptibility to A549 alveolar epithelial cells (2021)
  • Author(s): Sasaki Michihito、Kishimoto Mai、Itakura Yukari、Tabata Koshiro、Intaruck Kittiya、Uemura Kentaro、Toba Shinsuke、Sanaki Takao、Sato Akihiko、Hall William W.、Orba Yasuko、Sawa Hirofumi
  • Journal Title: Biochemical and Biophysical Research Communications Volume: 577 Pages: 146-151
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2021.09.015
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] ザンビアのエジプトルーセットオオコウモリおよびマストミスから分離されたロタウイルスAの性状解析 (2023)
  • Author(s): 岸本麻衣、梶原将大、高田礼人、大園誠也、鈴木忠樹 、伊藤直人、大場靖子、澤洋文、佐々木道仁
  • Organizer: 第166回日本獣医学会学術集会
• [Presentation] SARS-CoV-2非構造タンパク質のアミノ酸配列が関与するCOVID-19重症化メカニズム (2023)
  • Author(s): 岸本麻衣、鳥羽晋輔、上村健太朗、丸山優樹、日下部伸治、佐藤彰彦、大場靖子、澤洋文、佐々木道仁
  • Organizer: 第70回日本ウイルス学会学術集会
• [Presentation] 多様な哺乳類および鳥類デルタウイルスからサテライト/ヘルパーウイルスと宿主動物の共進化機構を紐解く (2023)
  • Author(s): 岸本麻衣、川崎純菜、北尾晃一、堀江真行
  • Organizer: NGS EXPO 2023
• [Presentation] 多様な哺乳類および鳥類デルタウイルスから紐解くサテライト/ヘルパーウイルスと宿主動物の共進化機構 (2023)
  • Author(s): 岸本麻衣、川崎純菜、北尾晃一、堀江真行
  • Organizer: 第46回日本分子生物学会年会
• [Presentation] ウイルス分離先行型スクリーニングにより分離された野生動物由来ロタウイルスAの性状解析 (2022)
  • Author(s): 岸本麻衣、梶原将大、高田礼人、伊藤直人、大場靖子、澤洋文、佐々木道仁
  • Organizer: 第69回日本ウイルス学会学術集会
• [Presentation] SARS-CoV-2非構造タンパク質によって規定されるCOVID-19重症化の分子機構 (2022)
  • Author(s): 岸本麻衣、鳥羽晋輔、上村健太朗、丸山優樹、日下部伸治、佐藤彰彦、大場靖子、澤洋文、佐々木道仁
  • Organizer: 第45回日本分子生物学会年会
• [Presentation] ザンビアに生息する野生げっ歯類動物における脳心筋炎ウイルス（EMCV）の疫学調査 (2021)
  • Author(s): 岸本麻衣、Bernard M. Hang’ombe、大場靖子、澤洋文、佐々木道仁
  • Organizer: 第164回日本獣医学会学術集会
• [Presentation] SARS-CoV-2と宿主II型膜貫通型セリンプロテアーゼ（TTSP）の相互作用 (2021)
  • Author(s): 岸本麻衣、上村健太朗、佐名木孝央、佐藤彰彦、大場靖子、澤洋文、佐々木道仁
  • Organizer: 第68回日本ウイルス学会学術集会
• [Presentation] SARS-CoV-2の感染を促進する宿主II型膜貫通型セリンプロテアーゼの同定 (2021)
  • Author(s): 岸本麻衣、上村健太朗、佐名木孝央、佐藤彰彦、大場靖子、澤洋文、佐々木道仁
  • Organizer: 第44回日本分子生物学会年会