| Project/Area Number |
22KJ1488
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| Project/Area Number (Other) |
22J23610 (2022)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2023)
Single-year Grants (2022) |
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| Section | 国内 |
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| Review Section |
Basic Section 27040:Biofunction and bioprocess engineering-related
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| Research Institution | University of Yamanashi |
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Principal Investigator |
横山 匠 山梨大学, 医工農学総合教育部, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2023-03-08 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥2,500,000 (Direct Cost: ¥2,500,000)
Fiscal Year 2024: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000)
Fiscal Year 2023: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000)
Fiscal Year 2022: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
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| Keywords | Directed evolution / SELEX / PUREシステム / mRNAディスプレイ / in vitro virus / 遺伝暗号拡張技術 / VEGF / VEGFR2 |
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| Outline of Research at the Start |
微生物由来の再構成型のin vitro転写・翻訳共役システム(Protein-synthesis Using Recombinant Elememts system, PUREシステム)と遺伝暗号拡張技術とin vitro virus (mRNAディスプレイ)法あるいはcDNAディスプレイ法を取り入れた分子進化工学的スクリーニング(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment, SELEX)法などを用いて、標的タンパク質に結合する新規非天然型環状Nアルキルペプチド化合物を同定する新規超高速スクリーニング技術の開発を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
これまでに、標的タンパク質結合ペプチド群の同時同定を可能にする新規スクリーニング技術の開発に利用するモデル標的タンパク質結合ペプチドとして、新規VEGFR2結合環状ペプチド化合物のSELEXスクリーニングを行なっていた。具体的には、微生物由来の再構成型のin vitro転写・翻訳共役システム（Polypeptide synthesis Using Recombinant Elements system, PUREシステム）と遺伝暗号拡張技術（genetic code expansion）とin vitro virus (mRNAディスプレイ)法を取り入れた分子進化工学的スクリーニング（Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment, SELEX）法を用いてNGS解析を行なった結果、VEGFR2に結合する新規非天然型環状ペプチド化合物を同定することに成功した。そこで、新規スクリーニング技術の原理にも利用している分子間相互作用に基づく近接効果を利用した、標的タンパク質の結合ペプチドを介したノックダウンへの応用も試みた。培養動物細胞に発現しノックダウンへと誘導する生体分子に結合する合成人工分子と、標的タンパク質に結合する環状ペプチド化合物との修飾環状ペプチド化合物を化学合成し、標的タンパク質を含む培養動物細胞系へと作用させた。ライブ蛍光イメージング解析および免疫ブロッティング解析の結果、いくつかの培養動物細胞において、修飾環状ペプチド化合物による標的膜タンパク質のノックダウン（減少）を検出することに成功した。同様に、免疫ブロッティング解析の結果、いくつかの培養動物細胞において、修飾環状ペプチド化合物による標的遊離タンパク質の細胞内への取り込み、および、細胞内でのノックダウン（減少）を検出することにも成功した。本研究成果は、日本薬学会第144年会で成果発表を行なっている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
微生物由来の再構成型のin vitro転写・翻訳共役システム（Polypeptide synthesis Using Recombinant Elements system, PUREシステム）と遺伝暗号拡張技術（genetic code expansion）とin vitro virus (mRNAディスプレイ)法を取り入れた分子進化工学的スクリーニング（Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment, SELEX）法を用いてNGS解析を行なった結果、VEGFR2に結合する新規非天然型環状ペプチド化合物を同定することに成功したため。また、新規スクリーニング技術の原理にも利用している分子間相互作用に基づく近接効果を利用した、標的タンパク質の結合ペプチドを介したノックダウンへの応用を試みるため、培養動物細胞に発現しノックダウンへと誘導する生体分子に結合する合成人工分子と、標的タンパク質に結合する環状ペプチド化合物との修飾環状ペプチド化合物を化学合成し、標的タンパク質を含む培養動物細胞系へと作用させ、ライブ蛍光イメージング解析および免疫ブロッティング解析の結果、いくつかの培養動物細胞において、修飾環状ペプチド化合物による標的膜タンパク質のノックダウン（減少）を検出することに成功し、免疫ブロッティング解析の結果、いくつかの培養動物細胞において、修飾環状ペプチド化合物による標的遊離タンパク質の細胞内への取り込み、および、細胞内でのノックダウン（減少）を検出することにも成功したため。そして、本研究成果を、日本薬学会第144年会で成果発表を行なったため。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでに、微生物由来の再構成型のin vitro転写・翻訳共役システム（Polypeptide synthesis Using Recombinant Elememts system, PUREシステム）と遺伝暗号拡張技術とin vitro virus（mRNAディスプレイ）法を取り入れた分子進化工学的スクリーニング（Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment, SELEX）法を用いて、VEGFR2に結合する新規非天然型環状ペプチド化合物を同定することに成功した。また、新規スクリーニング技術の原理にも利用している分子間相互作用に基づく近接効果を利用した、標的タンパク質の結合ペプチドを介したノックダウンへの応用を試みるため、培養動物細胞に発現しノックダウンへと誘導する生体分子に結合する合成人工分子と、標的タンパク質に結合する環状ペプチド化合物との修飾環状ペプチド化合物を化学合成し、標的タンパク質を含む培養動物細胞系へと作用させ、ライブ蛍光イメージング解析および免疫ブロッティング解析の結果、いくつかの培養動物細胞において、修飾環状ペプチド化合物による標的膜タンパク質のノックダウン（減少）を検出することに成功し、免疫ブロッティング解析の結果、いくつかの培養動物細胞において、修飾環状ペプチド化合物による標的遊離タンパク質の細胞内への取り込み、および、細胞内でのノックダウン（減少）を検出することにも成功した。そこで今後は、SELEXスクリーニングにより同定した新規VEGFR2結合環状ペプチド化合物をモデル標的タンパク質結合ペプチドとして、標的タンパク質結合ペプチド群の同時同定を可能にする新規スクリーニング技術を開発していく予定である。
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