| Project/Area Number |
22KJ1567
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| Project/Area Number (Other) |
22J14529 (2022)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2023)
Single-year Grants (2022) |
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| Section | 国内 |
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| Review Section |
Basic Section 37010:Bio-related chemistry
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
柴田 将成 名古屋大学, 理学研究科, 特別研究員(DC2)
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| Project Period (FY) |
2023-03-08 – 2024-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000)
Fiscal Year 2023: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000)
Fiscal Year 2022: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
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| Keywords | DNA / PNA / ペプチド核酸 / インベージョン / 結晶構造解析 / ヌクレオソーム |
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| Outline of Research at the Start |
ペプチド核酸（PNA）による特徴的な二本鎖DNA認識様式である「インベージョン」を構造学的に分析し、その適用範囲を生体内にまで拡張することで、人工核酸に基づく遺伝子工学ツールを構築する。またゲノムDNAの部分構造であるヌクレオソームを新たな標的とし、より生体内に近い条件でのインベージョンの挙動についてその詳細を解明する。これらの構造情報やその挙動の知見をもとに、目的に応じて合理的に設計した機能化PNAを開発し、生体内における配列特異的なDNA制御手法に展開する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
ペプチド核酸（PNA）は二本鎖DNAに対して「インベージョン」と呼ばれる特徴的な結合様式が可能である。本研究では、構造学的な分析によるインベージョンの生体内での二本鎖DNAを制御する基盤技術への展開を目指した。
PNAをparallel配向に設計し、化学修飾が不要なインベージョン手法を開発した。溶液中のイオン強度、温度の影響、ミスマッチ配列に対する選択性、標的塩基配列ごとの認識効率の変化を見出した。また、生理的条件下にてプラスミドDNAを認識可能なことを明らかにした。
Parallel配向のPNA/PNA二本鎖の結晶構造解析に取り組んだ。Parallel配向ではより熱安定性の高いantiparallel配向と比較して水分子を介した水素結合ネットワーク数が有意に少なく、配向性によって二本鎖の熱安定性に差が生じる要因となることが示唆された。
インベージョン複合体の部分構造となるparallel型PNA/DNA二本鎖のX線結晶構造解析に取り組んだ。重原子を有するウラシル塩基誘導体を導入したPNAオリゴマーを合成し結晶化を行った。X線回折実験により異常散乱を含むデータを収集し、現在モデル構築を進めている。また、インベージョン複合体の安定な形成に適したDNAおよびPNAの塩基配列、鎖長を詳細に設計することにより結晶化手法を確立した。さらにX線回折実験における測定試料への損傷を抑える抗凍結処理を実施し回折データの分解能を改善させた。
真核生物の生体内のDNAのモデルとして、ヒストンタンパク質とDNAを人工的に複合化したヌクレオソームを標的とし、蛍光標識したPNAによって結合可能か評価した。ヒストンタンパク質とDNAとの結合親和性が高い領域ではPNAの結合は確認されず、一方で親和性が低いと考えられるDNAの末端領域ではPNAが結合することが明らかとなった。
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