小脳神経回路を介した恐怖応答学習のメカニズムの解明

• Project/Area Number: 22KJ1601
• Project/Area Number (Other): 22J22387 (2022)
• Research Category: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• Allocation Type: Multi-year Fund (2023); Single-year Grants (2022)
• Section: 国内
• Review Section: Basic Section 44050:Animal physiological chemistry, physiology and behavioral biology-related
• Research Institution: Nagoya University
• Principal Investigator: 小山 航 名古屋大学, 理学研究科, 特別研究員(DC1)
• Project Period (FY): 2023-03-08 – 2025-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥3,400,000 (Direct Cost: ¥3,400,000); Fiscal Year 2024: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000); Fiscal Year 2023: ¥1,100,000 (Direct Cost: ¥1,100,000); Fiscal Year 2022: ¥1,200,000 (Direct Cost: ¥1,200,000)
• Keywords: 小脳 / ゼブラフィッシュ / 能動的回避学習 / カルシウムイメージング / 光遺伝学

Outline of Research at the Start

小脳は無意識下での運動学習、タイミング制御に関与することで知られる脳部位であるが、情動や社会性といった高次脳機能にも関与していることが明らかになりつつある。本研究では特に、恐怖応答学習における小脳の役割を明らかにする。
脊椎動物のモデル生物であるゼブラフィッシュの成魚に対し、頭部固定下で恐怖応答学習実験を実施する。学習中の小脳出力ニューロンに対して、カルシウムイメージングを実施し、学習中に小脳から他脳部位へ送られる情報を議論する。また、シナプス可塑性に関わる細胞内２次メッセンジャーを光遺伝学的に操作することで、小脳内のシナプス可塑性と恐怖応答学習の関係を明らかにする。

Outline of Annual Research Achievements

本研究は、能動的回避学習における小脳機能をゼブラフィッシュを用いて解明することを目的とする。能動的回避学習中の小脳ニューロンの活動をCa2+イメージングにより解析するため、バーチャルリアリティ(VR)空間において、顕微鏡下で頭部を固定したゼブラフィッシュ成魚個体に対し、能動的回避学習を行う実験系を導入した。このVR空間において、個体は電気ショック(US)とそれに連合付けられた特定の周囲の色(CS)の関係を学習し、CSに対して逃避行動を取るように訓練される。小脳において情報統合の役割を果たすプルキンエ細胞の神経活動を学習中に取得し解析したところ、CSの提示とCSからの逃避が完了したタイミングで、学習依存的に神経活動量が上昇することが明らかとなった。また、真骨魚類においての小脳から他の脳領域への出力を担うニューロンである広樹状突起細胞の活動を解析したところ、CSに応答するニューロン群(危険ニューロン)と、CS以外の周囲の色に応答するニューロン群(安全ニューロン)が学習依存的に出現することが明らかとなった。
また、以上の研究テーマと並行し、近年特性が明らかにされた様々な新規光遺伝学ツールの有用性をゼブラフィッシュにおいて検証した。各ツールを網様体脊髄路ニューロンに発現させた際の光刺激によるな遊泳応答と、心筋細胞に発現させた際の光刺激による心拍停止の効果を計測することにより、ツールの機能性を評価した。結果、カチオンチャネル型ロドプシンのGtCCR4、KnChR、細胞質中のcAMPやcGMPを上昇させる酵素共役型光遺伝学ツールOaPAC・bPAC・BeGC1、Gq型GPCRロドプシンのSpiRh1、SpiUV、Gi/o型GPCRロドプシンのMosOpn3、PufTMT、LamPPなどがゼブラフィッシュにおいて機能的に発現し、有望なツールであることが明らかとなった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

当初の目的通り、能動的回避学習中のゼブラフィッシュにおける小脳の神経活動を細胞腫ごとに取得することに成功した。また、カチオンチャネル型ロドプシンのGtCCR4、KnChR、酵素共役型光遺伝学ツールOaPAC・bPAC・BeGC1、Gq型GPCRロドプシンのSpiRh1、SpiUV、Gi/o型GPCRロドプシンのMosOpn3、PufTMT、LamPPなどがゼブラフィッシュにおいて機能的に発現し、光遺伝学ツールとして有望であることを見出し、２報の原著論文として発表した。次年度中に本研究をまとめられる予定であるため、おおむね順調に進展していると考える。

Strategy for Future Research Activity

これまでに見出された、能動的回避学習に関連する小脳の活動をさらに詳細に解析する。広樹状突起細胞のうち、「安全ニューロン」と「危険ニューロン」が投射する脳領域をエレクトロポレーション法により標識する。また、小脳内で行われる情報処理を明らかにするため、プルキンエ細胞を細胞死させた個体において、広樹状突起細胞の活動イメージングを行う。さらに、これまでに見出した新規光遺伝学ツールを用い、能動的回避学習中に見られる小脳ニューロンの活動を、阻害、もしくは促進することで、能動的回避学習において小脳での情報処理が果たす役割を明らかにしていく。

Research Products

• [Journal Article] Optogenetic manipulation of neuronal and cardiomyocyte functions in zebrafish using microbial rhodopsins and adenylyl cyclases (2023)
  • Author(s): Hagio Hanako、Koyama Wataru、Hosaka Shiori、Song Aysenur Deniz、Narantsatsral Janchiv、Matsuda Koji、Shimizu Takashi、Hososhima Shoko、Tsunoda Satoshi P、Kandori Hideki、Hibi Masahiko
  • Journal Title: eLife Volume: 12
  • DOI: 10.7554/elife.83975
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Optogenetic manipulation of Gq- and Gi/o-coupled receptor signaling in neurons and heart muscle cells (2023)
  • Author(s): Hagio Hanako、Koyama Wataru、Hosaka Shiori、Song Aysenur Deniz、Narantsatsral Janchiv、Matsuda Koji、Sugihara Tomohiro、Shimizu Takashi、Koyanagi Mitsumasa、Terakita Akihisa、Hibi Masahiko
  • Journal Title: eLife Volume: 12
  • DOI: 10.7554/elife.83974
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] Involvement of the cerebellar neural circuit in active avoidance learning in zebrafish. (2023)
  • Author(s): Koyama W, Tanimoto Y, Torigoe M, T Islam, Shimizu T, Okamoto H, Hibi H
  • Organizer: Cold Spring Harbor Meeting: zebarafish neurobiology
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Cerebellar neural circuit shows predictive activity to fear stimuli during active avoidance learning in zebrafish. (2023)
  • Author(s): Koyama W, Tanimoto Y, Torigoe M, T Islam, Shimizu T, Okamoto H, Hibi H
  • Organizer: The 29th Japanese Medaka and Zebrafish Meeting
• [Presentation] 能動的回避学習におけるゼブラフィッシュ成魚の小脳神経回路の役割 (2023)
  • Author(s): Koyama W, Tanimoto Y, Torigoe M, T Islam, Shimizu T, Okamoto H, Hibi H
  • Organizer: 第33回日本神経回路学会
• [Presentation] Optogenetic control of intracellular second messengers in neurons and heart muscle cells (2022)
  • Author(s): Wataru Koyama, Hanako Hagio, Aysenur Deniz Cayirtepe, Shiori Hosaka, Janchiv Narantsatsral, Koji Matsuda, Takashi Shimizu, Mitsumasa Koyanagi, Shoko Hososhima, Satoshi P. Tsunoda, Akihisa Terakita, Hideki Kandori, and Masahiko Hibi
  • Organizer: 17th International Zebrafish Conference
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] ゼブラフィッシュを用いた恐怖応答学習における小脳神経回路の役割の解明 (2022)
  • Author(s): 小山 航、細見 椋、松田 光司、川上 浩一、清水 貴史、日比 正彦
  • Organizer: NEURO2022
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Novel optogenetics tools work efficiently in neurons and myocardium in zebrafish (2022)
  • Author(s): Wataru Koyama, Hanako Hagio, Shiori Hosaka, Aysenur Deniz Cayirtepe, Janchiv Narantsatsral, Koji Matsuda, Takashi Shimizu, Mitsumasa Koyanagi, Shoko Hososhima, Satoshi P. Tsunoda, Akihisa Terakita, Hideki Kandori, and Masahiko Hibi
  • Organizer: 第28回 小型魚類研究会
  • Int'l Joint Research