| Project/Area Number |
22KJ2570
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| Project/Area Number (Other) |
22J23111 (2022)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2023)
Single-year Grants (2022) |
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| Section | 国内 |
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| Review Section |
Basic Section 47010:Pharmaceutical chemistry and drug development sciences-related
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
平野 元春 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2023-03-08 – 2025-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥2,500,000 (Direct Cost: ¥2,500,000)
Fiscal Year 2024: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000)
Fiscal Year 2023: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000)
Fiscal Year 2022: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
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| Keywords | 細胞膜透過性ペプチド / タンパク質間相互作用 / 超二次構造 / ヘリックスループヘリックス / 両親媒性構造 / α-ヘリックス / ヘリックス・ループ・ヘリックス構造 / 両親媒性ペプチド / ヘリカルペプチド |
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| Outline of Research at the Start |
細胞内のタンパク質間相互作用(PPI)を阻害可能なペプチドは、PPI阻害の創薬モチーフとして注目されているが、その多くは単独で細胞内移行することが難しく、細胞内で十分な機能を発揮できない。そのため、細胞膜透過性ペプチド(CPP) を用いたPPI阻害ペプチドの細胞内輸送が研究されている。そこで本研究では、研究室内で開発してきた二次構造制御型CPPを利用することで、細胞内外の環境に応じて構造が変化し、PPI阻害ペプチドの効率的な細胞内輸送を可能とするデリバリー手法の開発を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
生体内に存在する多くのタンパク質は、タンパク質-タンパク質間相互作用（Protein-Protein Interaction; PPI）することで様々な機能を発揮している。その一方で、細胞内PPIはガンをはじめとした多くの疾病の発症にも関与しているため、魅力的な創薬標的として注目されている。しかし、細胞内PPIの阻害は、低分子や抗体などの従来の分子では困難であるため、新規モダリティとして中分子ペプチドが注目されているが、一般的にペプチドは効率的に細胞内へ移行することが難しく、細胞内移行性を向上させる修飾が必要になる。特に、細胞膜透過性ペプチド（Cell-penetrating peptide; CPP）を細胞膜透過ドメインとしてPPI阻害ペプチドに結合させる方法が汎用されるが、エンドソーム脱出や両親媒性向上に伴う細胞毒性が問題となる。この課題を解決するため、超二次構造の一つであるHelix-loop-helix（HLH）構造に着目し、環境応答性の構造制御型新規CPPの開発を行った。
本研究では、前年度から引き続きビタミンD受容体（VDR）を標的としたHLHペプチドの開発を行い、生理活性評価をルシフェラーゼアッセイ、およびRT-qPCRで行った。また、新規のペプチドとして、p53-MDM2相互作用を阻害するMDM2標的のHLHペプチド開発を行い、ウェスタンブロッティング、およびRT-qPCRによる評価系の確立、生理活性評価を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は、前年度に見出したVDRを標的としたHLHペプチド（1）のPPI阻害活性評価、および誘導体の設計・合成を行なった。疎水性の高さに由来する非特異的な毒性を抑制するために、アミノ酸残基の側鎖間における疎水性相互作用を参考にして、ペプチド1を基に分子全体の疎水性を低下させたペプチドを設計・合成した。新たに合成したペプチドは、CDスペクトル測定による二次構造解析、およびタンパク質立体構造予測ツールAlphaFold2を用いた計算を行い、HLH構造を形成していることを確認した。次に、ルシフェラーゼアッセイ、およびRT-qPCRを行い、PPI阻害の活性を評価した。評価の結果、合成したHLHペプチドは細胞膜透過性が向上したにも関わらず、ルシフェラーゼアッセイ、およびRT-qPCR評価でともに顕著なPPI阻害活性を示さなかった。
また、新たにMDM2を標的としたp53-MDM2相互作用を阻害するHLHペプチドの開発を行なった。細胞膜透過ドメインには前年度同様に、申請者がこれまで開発を行ってきた両親媒性CPPを使用し、PPI阻害ドメインには、MDM2との結合に重要なp53のヘリカルドメインであるペプチドを用いた。PPI阻害活性は、p53の発現レベルの回復をウェスタンブロッティングで評価し、p53発現レベルの回復に伴うp53経路の再活性化をRT-qPCRで評価することにした。はじめに、p53-MDM2相互作用を効率的に阻害することが報告されているペプチドATSP-7041をポジティブコントロールとして使用し、PPI阻害活性評価の条件を検討した。決定した条件に従い、ウェスタンブロッティングおよびRT-qPCRによりPPI阻害活性評価を行なった結果、細胞膜透過性に乏しいp53pはPPI阻害活性を示さなかった。一方で、設計・合成したペプチドもまた、顕著なPPI阻害活性を示さなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、p53-MDM2相互作用を標的としたHLHペプチドの開発を行う。PPI（p53-MDM2）阻害活性の評価系は確立したため、使用しているPPI阻害ドメイン（p53p）が細胞内でPPI阻害活性を示すことを確認するとともに、別のPPI阻害ドメインとしてpDI（LTFEHYWAQLTS）を使用した新たなHLHペプチド設計・合成し、任意の構造、および目的の阻害活性を示すペプチドを開発していく。また、細胞内でのMDM2に対する結合親和性をNanoBRETにより評価する。
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