| Project/Area Number |
22KJ2618
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| Project/Area Number (Other) |
22J14623 (2022)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2023)
Single-year Grants (2022) |
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| Section | 国内 |
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| Review Section |
Basic Section 42020:Veterinary medical science-related
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| Research Institution | Osaka Metropolitan University |
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Principal Investigator |
木村 和人 大阪公立大学, 大学院獣医学研究科, 特別研究員(DC2)
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| Project Period (FY) |
2023-03-08 – 2024-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥1,700,000 (Direct Cost: ¥1,700,000)
Fiscal Year 2023: ¥800,000 (Direct Cost: ¥800,000)
Fiscal Year 2022: ¥900,000 (Direct Cost: ¥900,000)
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| Keywords | イヌiPS細胞 / 赤血球 / イヌ / iPS細胞 / 輸血 / ゲノム編集 / 中胚葉 / 造血幹細胞 / 赤芽球 |
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| Outline of Research at the Start |
輸血療法は、重度貧血や外科手術時の出血に対する唯一無二の治療法である。しかし、獣医療では、献血ドナー犬の安定確保が難しいうえに血液バンクがなく、血液不足が深刻な問題である。これに対し、iPS細胞は献血ドナーに依存しない赤血球の安定供給源となりうるため、輸血問題を解決できると期待されている。本研究では、獣医療における新規輸血療法の確立に向けた輸血用血液の安定供給を目指し、イヌiPS細胞を用いて、分化誘導時の培養環境とイヌiPS細胞の最適化により、効率的な赤血球作製法の解明を目指す。この目的達成のため、ゲノム編集により、作製した赤血球を抗体なしで解析できる評価系を新たに構築する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
iPS細胞は、献血ドナーに依存しない赤血球の安定供給源となりうる。本研究では、ゲノム編集により、赤血球マーカーレポーターイヌiPS細胞株の樹立を行うことで、iPS細胞由来赤血球の作製法を検討する上で必要とされる評価系を構築し、イヌiPS細胞を用いた効率的な赤血球作製法を明らかにすることを目的としている。本年度では、以下の成果が得られた。
1.ゲノム編集によるレポーターイヌiPS細胞株の樹立とその特性解析
CRISPR-Cas9システムにより、赤血球マーカーであるGYPA遺伝子座にEGFP遺伝子を挿入したレポーターイヌiPS細胞（GYPA-EGFPイヌiPS細胞）を作製し、抗体なしにイヌiPS細胞由来赤血球の検出および定量化を試みた。ノックイン用プラスミドベクターをイヌiPS細胞へ導入すると、目的の遺伝子座へのノックインに成功したことが示唆される細胞クローンが複数得られ、それらはiPS細胞特性を維持していた。さらに、これらのクローンから、われわれが構築したプロトコールで赤血球へ分化誘導した。その結果、分化細胞は、EGFPの発現が確認され、経時的にフローサイトメトリー解析を行ったところ、EGFP陽性細胞の割合は95%以上まで上昇した。これらのことから、GYPA-EGFPイヌiPS細胞の作製に成功し、イヌiPS細胞由来赤血球系譜細胞を抗体なしで簡便に解析可能となった。
2.イヌiPS細胞の培養条件の検討
イヌiPS細胞から赤血球を作製するうえで、イヌiPS細胞培養条件の効率化は非常に重要である。そこで、ヒト幹細胞用市販培地および足場剤がイヌiPS細胞培養へ応用可能か検討した。その結果、StemFlexまたはmTeSR Plus培地とビトロネクチンまたはGeltrexの足場剤を組み合わせることで、週末の培地交換なしに効率よくイヌiPS細胞を培養可能であることが明らかになった。
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