| Project/Area Number |
22KJ2661
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| Project/Area Number (Other) |
21J00755 (2021-2022)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2023)
Single-year Grants (2021-2022) |
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| Section | 国内 |
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| Review Section |
Basic Section 42030:Animal life science-related
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
伊藤 道俊 (2021, 2023) 慶應義塾大学, 環境情報学部, 特別研究員(PD)
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| Research Fellow |
伊藤 道俊 (2022) 慶應義塾大学, 環境情報学部, 特別研究員(PD)
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| Project Period (FY) |
2023-03-08 – 2024-03-31
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| Project Status |
Completed (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥5,200,000 (Direct Cost: ¥4,000,000、Indirect Cost: ¥1,200,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
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| Keywords | 緊縮応答 / ppGpp / MESH1 / シグナル伝達 |
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| Outline of Research at the Start |
細菌のストレス応答を包括的に制御する核酸分子、グアノシン四リン酸(ppGpp)が動物細胞でも検出された。しかし、その合成経路、応答するストレス、どのような代謝調節を行っているかなどは一切明らかになっていない。そこで本研究では、1. イオンクロマトグラフィー質量分析法(IC-MS)を用いた高感度なppGpp定量系の開発、2. 種々のストレス条件下におけるppGpp定量、3. ppGppと特異的に結合するタンパク質の同定、という実験を通して動物細胞におけるppGppの機能解明を行う。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、イオンクロマトグラフィー-質量分析法(IC-MS)を用いた動物細胞のppGpp定量系を開発し、動物の(p)ppGpp定量を行う上での課題であった、イオンペア試薬を用いない高感度(p)ppGpp定量の開発に成功した。この実験系を用いて、HeLa細胞の(p)ppGpp定量を行ったところ、ppGpp標準品とは異なるリテンションタイム(RT)を持つppGpp様シグナルが検出された。ヒトppGpp分解酵素MESH1欠損HeLa細胞、大腸菌のppGpp合成酵素RelA過剰発現HeLa細胞を作成してppGpp定量を行った。その結果、RelA過剰発現体からはppGpp標準品と同様のシグナルが得られたが、MESH1欠損体からは野生型と同様、ppGpp標準品とはRTが異なるシグナルが検出された。これらと、MSスペクトルの結果から、ヒト細胞から検出されるppGpp様シグナルはppGppのアナログであることが示唆された。
また、研究開始当初はppGppと結合するヒトタンパク質は一切確認されていなかったが、ヒトGTPセンサータンパク質であるPI5P4KβのGTP結合部位にppGppが結合することを明らかにした。この結果を受けて、ppGpp-conjugated beadsの作成を行い、ヒトのppGpp結合タンパク質の網羅的な解析を行う基盤づくりを行った。さらに、動物におけるppGpp合成酵素探索のため、ppGpp合成分解能を持たない大腸菌変異株を作成し、変異株に対してヒトの脳cDNAライブラリーを導入した。選択培地でスクリーニングを行ったところ、いくつかのコロニーが得られた。
これらの研究により、動物における(p)ppGppの生理的な役割を同定するまでは至らなかったが、今後のppGpp研究を進めていくうえで重要な基盤づくりを行う事ができた。
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