1分子蛍光観察による1細胞プロテオーム解析法の開発
| Project/Area Number |
22KJ3130
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| Project/Area Number (Other) |
21J01016 (2021-2022)
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| Research Category |
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
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| Allocation Type | Multi-year Fund (2023)
Single-year Grants (2021-2022) |
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| Section | 国内 |
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| Review Section |
Basic Section 43010:Molecular biology-related
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| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
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Principal Investigator |
日高 拓也 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 特別研究員(PD)
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| Project Period (FY) |
2023-03-08 – 2024-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2022: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2021: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | 1分子蛍光イメージング / 光シート顕微鏡 / プロテオミクス / 1細胞解析 / マイクロ流路デバイス |
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| Outline of Research at the Start |
タンパク質は細胞内機能の担い手であり、その網羅的な定量であるプロテオーム解析は、がん化や細胞分化における分子基盤の理解や疾病のバイオマーカー探索に活用されている。その中で、1 細胞プロテオーム解析の開発は集団機能における細胞個性の役割について重要な知見を与えると期待されるが、増幅が可能な核酸とは異なり技術的課題が多く、報告が少ない。本研究では、マイクロ流路デバイスにより1細胞内に含まれるタンパク質を蛍光標識し、電気泳動と超高感度顕微鏡用いた 1 分子蛍光観察を組み合わせることで、多数の細胞から同時にタンパク発現パターンを取得できる 1 細胞プロテオーム解析法の開発を行う。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究で実現を目指す1細胞プロテオーム解析システムに必要な技術要素として、1. マイクロ流路デバイスによる1細胞サンプルの調製、2. マイクロウェルゲルを用いたハイスループットな電気泳動、3. 光シート顕微鏡による超高感度定量の3つが挙げられる。
2022年度はマイクロ流路デバイスによる1細胞サンプル調製、およびマイクロウェルゲルによるサンプル捕捉の効率が著しく低いという課題に直面し、本研究で求めるハイスループットな解析が難しいことが分かったため、システムの大幅な変更を行った。1細胞サンプルの調製方法を1細胞ソーティングとマイクロビーズへのタンパク質吸着を組み合わせたものに切り替え、さらに得られるサンプルをロスなく電気泳動するためにゲルの設計を変更した。まだ実験的な検証が必要だが、この手法により一度のランで300程度の1細胞サンプルが解析できると考えている。
また並行して2021年度に作成した顕微鏡制御システムの拡張と画像解析プログラム作成を行った。前者は特に、ビーズ位置を自動検出するプログラムを追加し、サンプルのある箇所のみを観察するようステージ等を制御することで、ゲル観察にかかる時間の最小化を試みている。また後者は観察時に生じるZ方向のずれを補正するプログラムに加え、crop, deskew, Z projectionまでをパイプライン化できており、今後は1分子検出とその定量を行うプログラムを追加する予定である。その他マイクロビーズや蛍光色素、電気泳動条件の検討を行い、電気泳動におけるS/N比の向上や広範囲の分子量領域でのバンド分離を達成することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は当初予定したマイクロ流路デバイスを用いた1細胞サンプルの調製が難しいことが明らかとなり、戦略の大幅な変更が必要となったが、新たなサンプル調製法と電気泳動システムを開発できたことで、本研究で目指す1細胞プロテオミクス解析システムを構築する上で必要な各技術要素を確立することができた。顕微鏡制御システムの最適化と画像解析プログラムの開発も進んでおり、2023年度中にシステム構築の完了が十分に見込める。以上のことから本研究はおおむね順調に進展していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
最終年度となる2023年度では、これまでに確立してきた各技術要素を1つのパイプラインとして統合することで、目的とする1細胞プロテオミクス解析システムを構築する。また構築したシステムを用いて細胞周期や細胞分化におけるプロテオーム変化を捉えることで、本システムの有効性を示す。得られた結果は学会や論文等で積極的に発信し、技術普及に向けた改善点や本システムによりアプローチできる生物学的問題の探索を行うことで、より実用的なシステム開発を目指す。
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Report
(2 results)
Research Products
(6 results)
