Development of In-Depth Top-Down Proteomics Method for Comprehensive Analysis of Human Proteoforms
| Project/Area Number |
22KK0077
|
|---|
| Research Category |
Fund for the Promotion of Joint International Research (Fostering Joint International Research (B))
|
| Allocation Type | Multi-year Fund |
|---|
| Review Section |
Medium-sized Section 37:Biomolecular chemistry and related fields
|
|---|
| Research Institution | Ehime University |
|---|
Principal Investigator |
武森 信暁 愛媛大学, 学術支援センター, 講師 (40533047)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
星野 歩子 東京工業大学, 生命理工学院, 准教授 (00819964)
紺野 亮 公益財団法人かずさDNA研究所, ゲノム事業推進部, 特任研究員 (00935736)
川島 祐介 公益財団法人かずさDNA研究所, ゲノム事業推進部, ユニット長 (30588124)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2022-10-07 – 2025-03-31
|
| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2022)
|
| Budget Amount *help |
¥20,020,000 (Direct Cost: ¥15,400,000、Indirect Cost: ¥4,620,000)
Fiscal Year 2024: ¥7,540,000 (Direct Cost: ¥5,800,000、Indirect Cost: ¥1,740,000)
Fiscal Year 2023: ¥9,360,000 (Direct Cost: ¥7,200,000、Indirect Cost: ¥2,160,000)
Fiscal Year 2022: ¥3,120,000 (Direct Cost: ¥2,400,000、Indirect Cost: ¥720,000)
|
|---|
| Keywords | プロテオフォーム / トップダウンプロテオミクス / ミドルダウンプロテオミクス / GeLC-FAIMS-MS / エクソソーム / ゲル電気泳動 / 質量分析 / PEPPI-MS |
|---|
| Outline of Research at the Start |
生命機能を分子レベルで理解する上で、人体を構成するタンパク質の化学構造と生理機能の関係性を解明する意義は極めて大きい。生体内で１つの遺伝子から生み出される多様なタンパク質構造を包括的に明らかにするプロテオフォーム研究は、従来のタンパク質解析手法では困難であったが、タンパク質分子をまるごと質量分析システムに導入し、その構造情報を詳細に解析するトップダウンプロテオミクス法の登場により、飛躍的な進展を近年遂げている。本国際共同研究では、研究代表者が開発した高分解能タンパク質分画技術を相手国側の超高感度質量分析技術と組み合わせた革新的プロテオフォーム解析法を開発する。
|
| Outline of Annual Research Achievements |
本課題ではクリスティアン・アルブレヒト大学キール（CAU）のトップダウンプロテオミクス研究グループ（代表：Prof. Andreas Tholey）との国際共同研究により、質量分析による高深度なインタクトプロテオフォーム解析を可能にする新規トップダウンプロテオミクス法の開発を行う。今年度は、ポリアクリルアミドゲル内のインタクトタンパク質の高効率受動抽出法（PEPPI-MS）を活用したゲルベースのプロテオーム分画、C4カラムを用いた逆相液体クロマトグラフィによる追加分離、そしてフィールド非対称イオン移動度分光分析法（FAIMS）による気相中でのタンパク質イオン分離を組み合わせた多次元プロテオームサンプル分離技術（GeLC-FAIMS）の開発に成功しており、現在までにCAUが保有する高分解能Orbitrap質量分析装置とGeLC-FAIMSを組み合わせることにより、高深度トップダウンプロテオフォーム解析のための計測システムを構築することに成功している。また現状のトップダウンプロテオミクスワークフローでは解析が困難な50 kDa以上の高分子量プロテオフォームを計測するための新たな手法として、Glu-Cプロテアーゼによる限定消化処理とGeLC-FAIMSを組みわせた高深度ミドルダウンプロテオフォーム解析用のサンプル前処理ワークフロー開発に取り組み、開発したワークフローの性能評価をTholey研究室において実施した（2023年3月に研究代表が訪問）。市販のヒト培養細胞抽出物を用いた解析の結果、PEPPI-MSによる分画処理を行うことにより検出可能なGlu-C消化断片数が2.3倍増加することが明らかとなった。現在は開発ワークフローを用いて、ヒト乳がん細胞株（4175細胞）由来エクソソームサンプルのプロテオフォーム解析を進めている。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2023年3月のCAU訪問により、今年度予定していたGeLC-FIAMS-MSシステム構築およびミドルダウンプロテオフォーム解析のためのサンプル前処理ワークフロー開発を達成しており、開発した技術によるエクソソームのプロテオフォーム解析も順調に進んでいる。
|
| Strategy for Future Research Activity |
2023年度は、サンプルを丸ごとGlu-C消化した後に、消化断片をGeLC-FAIMSで分画するミドルダウンプロテオフォーム解析法（Global Middle-Down Proteomics）を開発したが、次年度は標的分子量領域のプロテオフォーム成分にフォーカスした高深度ミドルダウンプロテオフォーム解析を可能にするTargeted MIddle-Down Proteomics法を新たに開発し、従来のトップダウン解析アプローチでは計測不可能な微量エクソソームサンプル中の高分子量タンパク質成分（インテグリンなど）のプロテオフォーム解析に挑戦することを計画している。
|
Report
(1 results)
Research Products
(5 results)
