Development of a Practical Highly Sensitive Diagnostic Method for African Swine Disease in Vietnam and Elucidation of Its Environmental Dynamics

• Project/Area Number: 22KK0097
• Research Category: Fund for the Promotion of Joint International Research (Fostering Joint International Research (B))
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Medium-sized Section 42:Veterinary medical science, animal science, and related fields
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 山崎 渉 京都大学, 東南アジア地域研究研究所, 教授 (70393262)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 目堅 博久 宮崎大学, 産業動物防疫リサーチセンター, 准教授 (90633264) ; 一二三 達郎 鹿児島大学, 農水産獣医学域獣医学系, 准教授 (90790949)
• Project Period (FY): 2022-10-07 – 2027-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥20,150,000 (Direct Cost: ¥15,500,000、Indirect Cost: ¥4,650,000); Fiscal Year 2026: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000); Fiscal Year 2025: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000); Fiscal Year 2024: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000); Fiscal Year 2023: ¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000); Fiscal Year 2022: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
• Keywords: アフリカ豚熱 / 環境動態 / LAMP / 簡易DNA抽出 / 全血 / ポイントオブケア / 診断法

Outline of Research at the Start

グローバル化に伴うアフリカ豚熱の世界流行は世界の脅威である。アフリカ豚熱はアフリカ豚熱ウイルスによる豚とイノシシの熱性伝染病で、強い伝染性と90％を超える高い致死率を特徴とする。中国や朝鮮半島、東南アジアでも感染爆発が続いており、日本にも侵入の危機が迫っている。ベトナムでは、脆弱な水際防疫の強化が急務となっている。本研究では研究代表者らが新開発する高感度・経済的かつ簡易・迅速的なアフリカ豚熱診断法を用いて、イノシシや軟ダニサンプルからの高精度なフィールド調査を行う。

Outline of Annual Research Achievements

ベトナム国立農業大学と共同研究を実施し、高感度かつ迅速にアフリカ豚熱（ASF）を診断するための新技術の開発に成功した。ASFのパンデミックを抑制するためには、早期発見と早期封じ込めが重要だが、現場で使用できる実用的な検査法がないこと大きな障壁となっている。そこで、豚全血サンプルを用いた現場で実施できるASFの迅速かつ高感度なポイントオブケア検査（POCT）を開発し性能を評価した。89の豚全血検体をベトナムの養豚場から採取し、粗DNA抽出とLAMP（loop-mediated isothermal amplification）増幅を組み合わせてPOCTを実施した。その結果、開発したPOCTにより、豚の全血検体から10分以内に、極めて低コストかつ比較的容易に粗DNAを抽出することができた。POCT全体の所要時間は、DNA抽出開始から最終判定まで最大50分であった。従来のリアルタイムPCR検出と比較して、POCTは検出感度が1log低下したが、診断感度は100％（56/56）、診断特異度は100％（33/33）と同等であった。開発したPOCTは迅速かつ容易に実施でき、特別な装置を必要とすることなく実施可能である。開発したPOCTは、ASFの早期診断と侵入の封じ込めの促進に貢献できる可能性がある。さらに、豚・イノシシ口腔液から微量なウイルスを濃縮検出する方法を開発中であり、予備試験では従来の方法より10倍以上高感度な診断性能を得ている。さらなるサンプル収集とデータ解析を進めている。

ベトナム国立農業大学の若手研究者を京都大学に招聘し、遺伝子検査法を習得するための実技講習を行った。さらに、研究代表者と研究分担者である若手研究者がベトナム国立農業大学を訪問し、特別セミナーを若手研究者と学部生・大学院生向けに行い、学術交流を推進した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

全血を用いたアフリカ豚熱のポイントオブケア検査の共同開発に成功した（論文掲載済）。さらに、豚とイノシシ口腔液中に含まれる微量なアフリカ豚熱ウイルスの濃縮検出法の開発にも成功した。予備試験では従来の方法より10倍以上高感度な診断性能を得ており、順調に共同研究が進んでいる。さらに、日本側から若手研究者1名を派遣するともに、ベトナム側から1名の若手研究者を招聘することができた。また、来年度初頭にベトナム側の若手研究者3名を招聘するための事務手続きも進んでおり、学術交流と若手研究者の国際経験の涵養を順調に推進している。

Strategy for Future Research Activity

ベトナム側の共同研究者にサンプリングをしていただき、臨床サンプルを用いた開発法の性能評価を進める。ベトナム側の若手研究者3名を日本に招聘し、開発法などに関する様々な技術や知識を習得してもらう。日本側からも現地を訪問し、開発法の微修正、技術支援、サンプリング、相互交流などをすすめる。

Research Products

• [Int'l Joint Research] ベトナム国立農業大学(ベトナム)
• [Int'l Joint Research] ベトナム国立農業大学(ベトナム)
• [Journal Article] Molecular phylogenetic analysis of Echinococcus multilocularis from horses raised in Canada or Japan, using mitochondrial cytochrome b gene?targeted PCR (2024)
  • Author(s): Hifumi Tatsuro、Tanaka Tetsuya、Suzu Ichinosuke、Sato Miho、Akioka Kohei、Fujimata Chiaki、Shinkai Ryohei、Maeda Tsutomu、Kusakisako Kodai、Ikadai Hiromi、Miyoshi Noriaki
  • Journal Title: Food and Waterborne Parasitology Volume: 34 Pages: e00219-e00219
  • DOI: 10.1016/j.fawpar.2024.e00219
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Identification of human-to-primates viral spillover in Southeast Asia (2024)
  • Author(s): Youdill Ophinni, Chika Yamada, Michiko Fujisawa, Ryota Sakamo, Herman Hidaya, Wataru Yamazaki
  • Journal Title: 京都大学研究連携基盤持続可能社会創造ユニット 令和5年度研究成果報告書 Volume: 1 Pages: 39-42
• [Journal Article] Detection and phylogenetic analysis of Dabieshan tick virus and Okutama tick virus in ticks collected from Cape Toi, Japan (2023)
  • Author(s): Mekata Hirohisa、Kobayashi Ikuo、Okabayashi Tamaki
  • Journal Title: Ticks and Tick-borne Diseases Volume: 14 Issue: 6 Pages: 102237-102237
  • DOI: 10.1016/j.ttbdis.2023.102237
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Rapid detection of alveolar echinococcosis in hepatic nodules of horses by recombinase polymerase amplification assay . (2023)
  • Author(s): Hifumi, T., Tanaka, T., Sato, M., Akioka, K., Fujimata, C. and Miyoshi, N.
  • Journal Title: Vet. Anim. Sci. Volume: 20 Pages: 100291-100291
  • DOI: 10.1016/j.vas.2023.100291
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Development of a highly sensitive point‐of‐care test for African swine fever that combines EZ‐Fast DNA extraction with LAMP detection: Evaluation using naturally infected swine whole blood samples from Vietnam (2023)
  • Author(s): Ngan Mai Thi、Thi My Le Huynh、Xuan Dang Vu、Thi Bich Ngoc Trinh、Phan Le Van、Thi Hoa Nguyen、Quang Lam Truong、Thi Lan Nguyen、Notsu Kosuke、Sekiguchi Satoshi、Yamazaki Yasuko、Yamazaki Wataru
  • Journal Title: Veterinary Medicine and Science Volume: - Issue: 3 Pages: 1-8
  • DOI: 10.1002/vms3.1124
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Presentation] 東南アジアにおけるヒトから霊長類へのウイルス感染の特定 (2024)
  • Author(s): Youdill Ophinni, Chika Yamada, Michiko Fujisawa, Ryota Sakamo, Herman Hidaya, Wataru Yamazaki
  • Organizer: 京都大学研究連携基盤持続可能社会創造ユニットミーティング「東南アジアにおける持続可能社会構築に向けた防災・環境・地域研究」
• [Presentation] 鹿児島県大隅地域から検出されたRickettsia spp.におけるgltA、ompB、htrA遺伝子の分子疫学的特徴 (2023)
  • Author(s): 鈴一之将、木村仁美、芦原誠一、榮村奈緒子、一二三達郎、田仲哲也
  • Organizer: 令和5年度獣医学術九州地区学会
• [Presentation] 日本の食用馬の多包虫症における多包条虫のミトコンドリア・シトクロームb（cob）遺伝子を標的とした分子系統解析 (2023)
  • Author(s): 佐藤美穂、一二三達郎、田仲哲也、鈴一之将、秋岡幸兵、藤又千晶、新飼竜平、前田勉、草木迫浩大、筏井宏実、三好宣彰
  • Organizer: 令和5年度獣医学術九州地区学会
• [Presentation] Socio-ecological background to the frequency of emerging infectious diseases- the need for a planetary health approach as an effective countermeasure (2023)
  • Author(s): Wataru Yamazaki
  • Organizer: ドイツ日本研究所(DIJ)とSt. Andrews大学による合同ワークショップ
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Point-of-care rapid testing for disease detection (2023)
  • Author(s): Wataru Yamazaki
  • Organizer: Keeping Up with Contemporary Veterinary Public Health, UPLB
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Development of a highly sensitive and cost-effective point-of-care test for African swine fever with loop-mediated isothermal amplification detection: evaluation using naturally infected swine whole blood samples from Vietnam (2023)
  • Author(s): Mai Thi Ngan, Huynh Thi My Le, Vu Ngoc Dang, Trinh Thi Bich Ngoc, Le Van Phan, Nguyen Thi Hoa, Truong Quang Lam, Nguyen Thi Lan, Kosuke Notsu, Satoshi Sekiguchi, Yasuko Yamazaki, Wataru
  • Organizer: ISWAVLD 2023
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 東南アジアで流行する動物感染症 (2023)
  • Author(s): 山崎 渉
  • Organizer: 第105回東南アジア学会
  • Invited
• [Presentation] Development and clinical evaluation of a highly sensitive POCT (point-of-care testing) for early diagnosis and early containment of African swine fever (2023)
  • Author(s): Wataru Yamazaki
  • Organizer: East & Southeast Asia Regional Webinar (Part of GARD, or the Global Alliance for Rapid Diagnostics, co-sponsored by Michigan State University and De La Salle University)
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] 簡易迅速なDNA抽出とLAMP検出を組み合わせた、アフリカ豚熱の高感度な ポイントオブケア検査の開発：自然感染豚の全血検体を用いたベトナムでの評価 (2023)
  • Author(s): Wataru Yamazaki, Mai Thi Ngan, Huynh Thi My Le、Vu Ngoc Dang, Trinh Thi Bich Ngoc、Le Van Phan, Nguyen Thi Hoa, Truong, Quang Lam, Nguyen Thi Lan, Yasuko Yamazaki, Kosuke Notsu, Satoshi Sekiguchi
  • Organizer: 第14回LAMP研究会
• [Presentation] Principles of the LAMP method and its application to the early diagnosis of African swine fever (2023)
  • Author(s): Wataru Yamazaki
  • Organizer: Special Lectures on Tick Biology and Rapid Diagnostic (held by UPLB, College of Veterinary Medicine)
  • Invited
• [Presentation] Principles of the LAMP method and its application to the early diagnosis of African swine fever (2023)
  • Author(s): Wataru Yamazaki
  • Organizer: Special Lectures on African swine fever (held by Vietnam National University of Agriculture )
  • Invited
• [Remarks] 簡易DNA抽出法とLAMP検出法を組み合わせたアフリカ豚熱の高感度なフィールド検査法の開発
  • URL: https://kyoto.cseas.kyoto-u.ac.jp/news/2023/04/20230406/
• [Remarks] Development of a highly sensitive POC test for ASF
  • URL: https://kyoto.cseas.kyoto-u.ac.jp/en/news/2023/04/20230406/
• [Remarks] Discussing the implementation ...
  • URL: https://eng.vnua.edu.vn/news-and-events/discussing-the-implementation-of-the-collaborative-research-project-on-african-swine-fever-with-japanese-partners-55379
• [Remarks] Discussing the implementation ...(Vietnamese)
  • URL: https://vnua.edu.vn/tin-tuc-su-kien/hop-tac/thao-luan-trien-khai-du-an-hop-tac-nghien-cuu-ve-dich-ta-lon-chau-phi-voi-cac-doi-tac-nhat-ban-55373
• [Remarks] キックオフミーティングおよびセミナー開催（日本語）
  • URL: https://kyoto.cseas.kyoto-u.ac.jp/news/2023/02/20230215/
• [Remarks] キックオフミーティング開催（ベトナム語）
  • URL: https://khoathuy.vnua.edu.vn/truong-du-an-hop-tac-quoc-te-cua-trung-tam-nghien-cuu-dong-nam-a-dai-hoc-kyoto-nhat-ban-den-tham-va-lam-viec-voi-khoa-thu-y-hoc-vien-nong-nghiep-viet-nam/
• [Remarks] セミナー開催（ベトナム語）
  • URL: https://khoathuy.vnua.edu.vn/seminar-khoa-hoc-voi-chu-de-nguyen-ly-cua-phuong-phap-khuech-dai-gen-dang-nhiet-lamp-va-ung-dung-trong-chan-doan-som-benh-dich-ta-lon-chau-phi/