グレリン受容体のシグナル伝達選択機構の構造基盤

• Project/Area Number: 22KK0099
• Research Category: Fund for the Promotion of Joint International Research (Fostering Joint International Research (B))
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Medium-sized Section 43:Biology at molecular to cellular levels, and related fields
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 浅田 秀基 京都大学, 医学研究科, 特定准教授 (20399041)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 椎村 祐樹 久留米大学, 付置研究所, 助教 (40551297) ; 堤 尚孝 岡山大学, 医歯薬学域, 助教 (70963495)
• Project Period (FY): 2022-10-07 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2022)
• Budget Amount: ¥20,020,000 (Direct Cost: ¥15,400,000、Indirect Cost: ¥4,620,000); Fiscal Year 2025: ¥4,030,000 (Direct Cost: ¥3,100,000、Indirect Cost: ¥930,000); Fiscal Year 2024: ¥8,060,000 (Direct Cost: ¥6,200,000、Indirect Cost: ¥1,860,000); Fiscal Year 2023: ¥5,980,000 (Direct Cost: ¥4,600,000、Indirect Cost: ¥1,380,000); Fiscal Year 2022: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
• Keywords: Gタンパク質共役受容体 / グレリン受容体 / バイスシグナリング / クライオ電子顕微鏡

Outline of Research at the Start

Gタンパク質共役受容体（GPCR）は、細胞膜に存在し、細胞外の情報を細胞内へ伝達する重要な役割を担う。そのため重要な創薬標的である。本研究では、食欲や成長ホルモンの分泌に重要な役割を担うGPCRであるグレリン受容体に焦点をあて、その特徴的なシグナル伝達機構を構造から明らかにし、創薬に向けた重要な情報を提供する。

Outline of Annual Research Achievements

主要な創薬ターゲットであるGタンパク質共役型受容体 (GPCR) は、細胞外の刺激を受容するとその構造を変化させ、Gタンパク質やβアレスチンなどの細胞内シグナル伝達因子との複合体形成を介してそれぞれに対応した細胞応答を惹起する。グレリンは、胃から分泌されるペプチドホルモンで、GPCRであるグレリン受容体（GHSR）に作用して摂食亢進や成長ホルモンの分泌促進などの多彩な生理作用を示す。これらの生理作用は、Gq/11、Gs、Gi/o、G12/13、さらにβアレスチンといった多くのシグナル伝達経路を活性化されることに由来される。従って、グレリン受容体/シグナル伝達因子の構造基盤を十分にすることができれば、シグナル伝達因子を選択する分子機構の理解やシグナル伝達経路の全体像の把握することが可能となり、GHSR関連疾患に対する医薬品の開発へ繋がる。
そのために本年度はcryo-EM単粒子解析法によるGHSR-Gタンパク質複合体の構造決定に資するGHSRおよびGタンパク質の発現・精製を行った。発現方法は先行研究で我々が明らかにした不活性型GHSRの構造と同様にsf9昆虫細胞を用いて行った。また、アゴニストが結合した活性型GHSRに共役する3量体Gタンパク質をGHSRと同時に感染させる共発現法により複合体を生産した。これらの複合体はcryo-EM測定に十分な質であることがゲル濾過の分散およびCBB染色像から確認できた。現在、このサンプルについてcryo-EMによる測定および単粒子解析法による解析中である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究目的達成のため、令和4年度はGHSRの発現・精製方法の確立およびシグナル伝達因子の発現・精製を試みた。cryo-EM測定用サンプル調製として、GHSR、3量体Gタンパク質構成タンパク質であるGq、Gβ、Gγ、さらに３量体Gタンパク質を安定化させるNB35、scFV16をまとめてSf9昆虫細胞に感染させる共発現法により発現させた。本研究では、GHSRのC末端にLgBiTを、GβのC末端にHiBiTを付加するTethering systemを採用しており、共発現時にS1PR3とGβが複合体を形成している。また、GHSRのN末端側にはアフィニティ精製用のHisタグが付加されており、精製はこのタグを用いたアフィニティー精製、およびゲル濾過法を用いた。また、界面活性剤の選択を行った結果、先行研究で使用していたn-Dodecyl-β-D-maltoside（DDM）と異なり、Lauryl Maltose Neopentyl Glycol（MNG）とglyco-diosgenin（GDN）の混合することでcryo-EM観察における粒子の質向上が認められた。これらのサンプルの質は、加速電圧200kVのスクリーニング電顕（Glacios）によりチェックした。このスクリーニングからサンプル調製法を確立し、その方法で得られたサンプルを用いて300kV cryo-EM（Titan）で測定した。その結果、アゴニスト-GHSR-Gq複合体構造のデータ収集に成功した。さらに、Gs、Gi/o、G12/13の発現にも成功しており、これらの複合体のcryo-EM単粒子解析の準備は整ったと考えられる。

Strategy for Future Research Activity

β-arrestin以外のシグナル伝達因子との複合体形成にはGqでの成功例と同様にsf9昆虫細胞によるTethering systemによる発現・精製を行う。一方、β-arrestin/GHSR複合体の形成においてGHSRのリン酸化が必要であるため、Gタンパク質との共役と異なりTethering systemによる発現・精製が利用できず、野生型GHSRの発現・精製が必須となる。そのため、令和5年度はcryo-EM単粒子解析に必要なβ-arrestinおよびGRKの発現、精製手法を海外共同研究者であるスタンフォード大学のコビルカ博士の元へ学びに行く予定であり、これらを日本サイトでも再現する。さらに、Expi293細胞を用いた野生型GHSR単体の発現系を構築する。
構造解析に向けたβ-arrestinおよびGRKの発現、精製手法の確立と並行してバイアスドリガンドの選定を行う。GHSRにはいくつかのアゴニストが存在しており、NanoBiT assay法を用いてそれらがどのシグナル伝達因子と共役しやすいのか評価する。その結果によりアゴニストと共役させるシグナル伝達因子の組み合わせを決定する。発現・精製できた複合体サンプルから順次cryo-EM測定を行い、構造を決定していく。

Research Products

• [Int'l Joint Research] スタンフォード大学(米国)