Evolution of malignant tumors starting from polyploid giant cancer cells

• Project/Area Number: 22KK0110
• Research Category: Fund for the Promotion of Joint International Research (Fostering Joint International Research (B))
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Review Section: Medium-sized Section 48:Biomedical structure and function and related fields
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 田守 洋一郎 京都大学, 医学研究科, 准教授 (10717325)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 榎本 篤 名古屋大学, 医学系研究科, 教授 (20432255) ; 石原 すみれ 北海道大学, 先端生命科学研究院, 助教 (70905752)
• Project Period (FY): 2022-10-07 – 2027-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥20,020,000 (Direct Cost: ¥15,400,000、Indirect Cost: ¥4,620,000); Fiscal Year 2026: ¥3,380,000 (Direct Cost: ¥2,600,000、Indirect Cost: ¥780,000); Fiscal Year 2025: ¥4,940,000 (Direct Cost: ¥3,800,000、Indirect Cost: ¥1,140,000); Fiscal Year 2024: ¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000); Fiscal Year 2023: ¥5,200,000 (Direct Cost: ¥4,000,000、Indirect Cost: ¥1,200,000); Fiscal Year 2022: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
• Keywords: がん細胞進化 / 多倍体細胞 / 腫瘍浸潤 / ショウジョウバエ / 倍数性変化 / 異数体 / 多倍体 / 染色体異常

Outline of Research at the Start

悪性腫瘍組織に多倍体化細胞が観察されることは、以前から数多く報告されている。この多倍体化巨細胞は強いストレス耐性を持つことから、腫瘍悪性化のプロセスに重要な役割を持っていると考えられているが詳細は分かっていない。本研究では、複数の実験モデル（ショウジョウバエ遺伝学、哺乳類培養細胞、ヒト病理検体）による多角的な解析、そして国際共同研究拠点での新しい解析技術（連続腫瘍移植モデル、タイムラプス一細胞ゲノミクス）を組み合わせることにより、多倍体化巨細胞の分裂がどのようにして始まるのか、その分裂により生じる様々な核型を持つ細胞群からどのような細胞が悪性形質の発現に至るのかを明らかにする。

Outline of Annual Research Achievements

これまでの研究から、ショウジョウバエの翅原基上皮組織に誘導したがん原性変異細胞（極性形成に関わるlglもしくはscribbleの変異とがん原遺伝子Rasの活性化の二重変異）からなる腫瘍が、基底膜を破って間質側に侵入すると、非常に高い確率で巨核を持った細胞が数多く出現することを観察していた。一方、FACSによるDNA量解析や、共焦点顕微鏡によるイメージングベースの倍数性解析によって徹底的な検証を行ったところ、これら大部分の浸潤性腫瘍細胞は２倍体を維持しており、ごく少数の細胞だけが多倍体化していることが分かってきた。この観察結果は当初の仮説とは異なるものであるが、実際の浸潤性のがん組織内に存在する多倍体化細胞も少数であるため、多倍体がん細胞のモデルとしては、より実際の状況の再現性が高いモデルということができる。
この腫瘍モデルに対してさらに行なった解析において、間質側へ侵入した腫瘍では、大部分の細胞でクロマチンの状態に大きな変化が起こっていることが分かってきた。具体的には、DAPIを用いたDNA染色で、浸潤性腫瘍内の大部分の細胞で核自体のサイズは大きくなっているものの、多くの細胞でヘテロクロマチン領域と考えられる部分は増加しており、その他の領域が核内で分散している様子が確認された。これらの浸潤性腫瘍細胞モデルにおけるクロマチン状態と倍数性の変化の基本的な観察結果について、代表者自ら遺伝研研究会として企画および主宰を行なった「倍数性研究会」を含め、国内外の複数の学会で発表した。さらに、これらの基礎データを含めた英文総説を発表した。
また、浸潤性腫瘍の大部分の細胞でクロマチン状態が変化していることから、これに関係する因子を探るために、今年度は一細胞レベルでのエピゲノム解析（scATAC-seq）を実施した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

令和５年度は８月に約３週間、研究代表者が本国際共同研究の海外拠点（Tulane University）へ赴き、ショウジョウバエでの腫瘍組織の長期間に渡るタイムラプスデータを取得するための腫瘍連続移植実験の予備実験を実施することができた。日本の研究室でも同実験を実施できるように、実験のプロトコルを習得し、必要機材などの情報を日本へ持ち帰るという、今回の訪問の目的を達成することができた。さらに、この海外拠点での予備実験では、当研究室で開発した翅原基上皮組織の領域特異的な強制発現用ドライバー（K42-Gal4）を用いてがん原性変異のRasV12の発現を誘導する翅原基腫瘍を、成虫の腹腔内に移植する移植実験を試行した。Tulane Universityの共同研究先がこれまでの研究で開発した腫瘍移植モデルは、唾液腺原基に誘導した腫瘍であったが、今回の予備実験により、我々の翅原基の腫瘍でも可能であることを確認することができた。
また、ショウジョウバエ翅原基上皮組織の腫瘍モデルにおいて、計画していたタイムラプスでの一細胞トランスクリプトーム解析（scRNA-seq）を実施した。これはモザイククローン誘導３日後、４日後、５日後の腫瘍における遺伝子発現の違い、不均一性の変遷を一細胞レベルで解析するためのものであり、現在データ解析を実施中である。

Strategy for Future Research Activity

ここまで、特にショウジョウバエを用いた浸潤性腫瘍モデルを用いた実験は順調に進んでおり、今後は計画通りさらに様々な実験モデルを用いた解析を進める予定である。
また令和５年度に、本国際共同研究の海外拠点（Tulane University）に赴いて、ショウジョウバエの腫瘍組織の長期間に渡るタイムラプスデータを取得するための腫瘍連続移植実験の予備実験を実施し、実験のプロトコルや必要機材などの情報を収集することができた。今後これをもとに、同実験を日本の研究室でも実施できるように研究代表者の研究室に設備を整えていく。また、今年度もTulane Universityの共同研究先に赴いて、当研究室で開発した翅原基上皮組織の腫瘍モデルと、共同研究先が持つ唾液腺原基の腫瘍モデルの両方を用いて、実際の連続移植実験を行う予定である。
また、ショウジョウバエの浸潤性腫瘍モデルにおいて、浸潤性腫瘍の大部分の細胞でクロマチン状態が変化していることが分かったことにより、当初描いていた研究計画にさらに新しい方向性が出てきた。この新しい方向性をさらに展開していくために、同浸潤性腫瘍モデルにおいて今後さらに様々なヒストン修飾状態の追跡を行う予定である。また、クロマチン状態変化の詳細な解析を行うために実施した一細胞レベルでのエピゲノム解析（scATAC-seq）のデータを、これまでに得ている同サンプルの一細胞トランスクリプトーム（scRNA-seq）のデータと統合解析を実施することにより、浸潤性腫瘍細胞の核内で生じている現象と浸潤性についての関係性をさらに追跡していく予定である。

Research Products

• [Int'l Joint Research] Tulane University/University of Minnesota(米国)
• [Int'l Joint Research] Tulane University/University of Minnesota(米国)
• [Journal Article] Polyploid Cancer Cell Models in Drosophila (2024)
  • Author(s): Wang Yuqing、Tamori Yoichiro
  • Journal Title: Genes Volume: 15 Issue: 1 Pages: 96-96
  • DOI: 10.3390/genes15010096
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Attachment and detachment of cortical myosin regulates cell junction exchange during cell rearrangement in the Drosophila wing epithelium (2023)
  • Author(s): Ikawa Keisuke、Ishihara Shuji、Tamori Yoichiro、Sugimura Kaoru
  • Journal Title: Current Biology Volume: 33 Issue: 2 Pages: 263-275.e4
  • DOI: 10.1016/j.cub.2022.11.067
  • Peer Reviewed
• [Presentation] がん細胞進化の起点となる Polyploid Cells (2023)
  • Author(s): 田守洋一郎
  • Organizer: 第１回倍数性研究会
  • Invited
• [Presentation] 浸潤を始めた腫瘍における細胞群間の不均一性と協調性の関係 (2023)
  • Author(s): Asuka Ishii, Junki Ikeguchi, Yasuyuki Fujita, Yoichiro Tamori
  • Organizer: 第46回日本分子生物学会年会
• [Presentation] Tumor invasion initiates at Invasion Hotspots, an epithelial tissue-intrinsic microenvironment (2023)
  • Author(s): Yoichiro Tamori
  • Organizer: 27th European Drosophila Research Conference
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Tumor invasion initiates at Invasion Hotspots, an epithelial tissue-intrinsic microenvironment (2023)
  • Author(s): Yoichiro Tamori
  • Organizer: Fly Bayou Symposium
  • Int'l Joint Research / Invited
• [Presentation] Tumor invasion initiates at Invasion Hotspots, an epithelial tissue-intrinsic microenvironment (2023)
  • Author(s): Rei Kobayashi, Junki Ikeguchi, Sheng Deng, Yasuyuki Fujita, Yoichiro Tamori
  • Organizer: 64th Annual Drosophila Research Conference
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] Tumor invasion initiates at Invasion Hotspots, an epithelial tissue-intrinsic microenvironment (2022)
  • Author(s): Rei Kobayashi, Yasuyuki Fujita, Yoichiro Tamori
  • Organizer: 第15回 日本ショウジョウバエ研究会
• [Presentation] Endoreplication-induced polyploidy in tumor invasion (2022)
  • Author(s): Sheng Deng, Yasuyuki Fujita, Yoichiro Tamori
  • Organizer: 第15回 日本ショウジョウバエ研究会
• [Presentation] Attachment/detachment of cortical Myosin regulates cell junction exchange during cell rearrangement (2022)
  • Author(s): Keisuke Ikawa, Shuji Ishihara, Yoichiro Tamori, Kaoru Sugimura
  • Organizer: 第15回 日本ショウジョウバエ研究会
• [Presentation] がん細胞進化における必然性と倍数性 (2022)
  • Author(s): 田守 洋一郎
  • Organizer: 第95回 日本生化学会大会
  • Invited
• [Presentation] ショウジョウバエin vivoモデルを用いたLeader-Follower細胞を伴う浸潤性腫瘍の細胞周期制御機構の解析 (2022)
  • Author(s): Junki Ikeguchi, Sheng Deng, Rei Kobayashi, Yasuyuki Fujita, Yoichiro Tamori
  • Organizer: 第45回 日本分子生物学会年会