伸長胚選別によるウシＥＳ細胞キメラ作出の効率化

• Project/Area Number: 23380169
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• Allocation Type: Single-year Grants
• Section: 一般
• Research Field: Integrative animal science
• Research Institution: National Institute of Agrobiological Sciences
• Principal Investigator: 古澤 軌 独立行政法人農業生物資源研究所, その他部局等, 研究員 (00343997)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 木村 康二 岡山大学, 環境生命科学科, 准教授 (50355070) ; 松山 秀一 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構, 家畜繁殖研究グループ, 主任研究員 (50455317)
• Project Period (FY): 2011-04-01 – 2016-03-31
• Project Status: Declined (Fiscal Year 2015)
• Budget Amount: ¥18,070,000 (Direct Cost: ¥13,900,000、Indirect Cost: ¥4,170,000); Fiscal Year 2015: ¥3,120,000 (Direct Cost: ¥2,400,000、Indirect Cost: ¥720,000); Fiscal Year 2014: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000); Fiscal Year 2013: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000); Fiscal Year 2012: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000); Fiscal Year 2011: ¥6,370,000 (Direct Cost: ¥4,900,000、Indirect Cost: ¥1,470,000)
• Keywords: ウシES細胞 / 伸長胚 / ゲノム編集 / ゲノム改変

Outline of Annual Research Achievements

[ウシES細胞の高品質化]
幹細胞マーカーであるPOU5F1の発現量をTet-onシステムで調節可能なウシES細胞株を樹立した。
①キメラ形成能を調べるため、DiIで蛍光標識したES細胞を5個注入した8-16細胞期のマウスあるいはウシ胚をドキシサイクリン（Dox）存在（1μg/ml）、非存在下で培養し、胚盤胞期胚における局在を調べた。8細胞期のマウス胚をホストとした場合、3株中2株において、Dox 存在下の方がICM（inner cell mass）に局在する割合が1.8-3.2倍有意に高かった。Doxの添加時間を0、12、24、及び48時間に設定して局在を比較したところ、24時間ではICMへの局在が2倍以上に増加するものの、それ以上の添加は効果が認められなかった。8-16細胞期のウシ胚をホストにした場合もDox添加24時間でICMへの局在及び取り込みがそれぞれ2倍以上に増加したが、48時間以上の添加は胚発生に悪影響が認められた。TE（trophectoderm）への局在も増加したことから、Dox添加によるPOU5F1の上昇は細胞の未分化性よりも生存性の維持に影響を与え、寄与率が増加したと考えられた。
②ウシES細胞とマウスES細胞を2日間単独、あるいは混合培養したマトリゲルビーズをDoxを徐放的に放出する浸透圧ポンプとともにヌードマウスに移植し、3週間後に腫瘍を回収して、蛍光観察及び免疫組織学的解析によりテラトーマ形成能を調べた。ウシES細胞のビーズを単独、あるいはマウスES細胞と隣接して移植した場合、ウシES細胞由来の奇形腫形成が認められたものの、特定の細胞系譜へ分化した像は観察できなかった。一方、両者を混合培養したビーズを移植したところ、マウスES細胞由来のテラトーマ中にウシES細胞由来の上皮、神経叢、血管内皮、及び腺組織が認められたことから、分化誘導をサポートする組織が存在することにより三胚葉に分化し得ることが確認された。

Research Progress Status

翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。

Strategy for Future Research Activity

翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。

Research Products

• [Journal Article] Successful Nonsurgical Transfer of Bovine Elongating Conceptuses and Its Application to Sexing (2014)
  • Author(s): Koji Kimura and Shuichi Matsuyama
  • Journal Title: Journal of Reproduction and Development Volume: 60 Issue: 3 Pages: 210-215
  • DOI: 10.1262/jrd.2013-137
  • NAID: 130003390835
  • ISSN: 0916-8818, 1348-4400
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Characteristics of bovine inner cell mass-derived cell lines and their fate in chimeric conceptuses (2013)
  • Author(s): Furusawa T, Ohkoshi K, Kimura K, Matsuyama S, Akagi S, Kaneda M, Ikeda M, Hosoe M, Kizaki K, Tokunaga T
  • Journal Title: Biology of Reproduction Volume: 89（2）：28 Issue: 2 Pages: 1-12
  • DOI: 10.1095/biolreprod.112.106641
  • Peer Reviewed
• [Presentation] ウシDDX4プロモーター制御下でDsRedを発現するトランスジェニックマウスの解析 (2014)
  • Author(s): 1)古澤軌, 大越勝広, 細江実佐, 池田光美, 赤木悟史, 木村康二, 松山秀一, 徳永智之
  • Organizer: 第107回日本繁殖生物学会
  • Place of Presentation: 帯広畜産大学
  • Year and Date: 2014-08-21 – 2014-08-24
• [Presentation] POU5F1発現誘導システムによる高品質ウシES細胞樹立の試み (2014)
  • Author(s): 2)池田光美, 古澤軌, 大越勝広, 細江実佐, 木村康二, 松山秀一, 赤木悟史, 徳永智之
  • Organizer: 第107回日本繁殖生物学会
  • Place of Presentation: 帯広畜産大学
  • Year and Date: 2014-08-21 – 2014-08-24
• [Presentation] 伸長胚移植によるウシES様細胞の多能性解析 (2013)
  • Author(s): 池田光美, 古澤軌, 大越勝広, 細江実佐, 木村康二, 松山秀一, 赤木悟史, 金田正弘, 木崎景一郎, 徳永智之
  • Organizer: 第106回日本繁殖生物学会大会
  • Place of Presentation: 東京農工大学農学部府中キャンパス
• [Presentation] A feature of self-renewal porcine embryonic stem cell-like cell lines established by inhibitors (2013)
  • Author(s): Haraguchi S
  • Organizer: Reproduction, Fertility and Development
  • Place of Presentation: ドイツ
• [Presentation] ウシ胚性幹細胞の利用技術の開発 (2013)
  • Author(s): 古澤軌
  • Organizer: NIAS/NILGS合同シンポジウム
  • Place of Presentation: つくば市
  • Invited
• [Presentation] Heterogeneity of embryonic stem cells and its application to generation of transgenic animals (2012)
  • Author(s): Furusawa T
  • Organizer: 第105回日本繁殖生物学会 日-チェコ交流シンポジウム
  • Place of Presentation: 東京
  • Invited
• [Presentation] 第2卵割抑制によるウシ体外受精由来4倍体胚の作製と体外発生能の検討 (2012)
  • Author(s): 大越勝広
  • Organizer: 第105回日本繁殖生物学会
  • Place of Presentation: つくば市
• [Presentation] ウシ胚由来多能性幹細胞に関する研究の状況 (2012)
  • Author(s): 徳永智之
  • Organizer: 第53回日本哺乳動物卵子学会
  • Place of Presentation: 千里ライフサイエンスセンター
  • Invited
• [Presentation] IVF胚及びSCNT胚由来ウシES細胞の遺伝子発現及びメチル化パターンの差違 (2011)
  • Author(s): 古澤軌, 池田光美, 細江実佐, 金田正弘, 赤木悟史, 大越勝広, 木崎景一郎, 徳永智之
  • Organizer: 第104回日本繁殖生物学会
  • Place of Presentation: いわて県民情報交流センター・アイーナ
  • Year and Date: 2011-09-16
• [Presentation] IVF胚及びSCNT胚由来ウシES細胞核移植胚の発生能とメチル化状態の差違 (2011)
  • Author(s): 池田光美, 水谷英二, 金田正弘, 赤木悟史, 細江美佐, 大越勝広, 古津軌, 野口龍生, 徳永智之
  • Organizer: 第104回日本繁殖生物学会
  • Place of Presentation: いわて県民情報交流センター・アイーナ
  • Year and Date: 2011-09-15
• [Remarks] 生物研ニュース47
  • URL: http://www.nias.affrc.go.jp/newsletter/news/2013/News47_html/kaigi1.html