細胞性免疫に関与する昆虫サイトカインの微生物感染による活性化機構の解析

• Project/Area Number: 23580069
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Research Field: Applied entomology
• Research Institution: Hokkaido University
• Principal Investigator: 落合 正則 北海道大学, 低温科学研究所, 准教授 (10241382)
• Project Period (FY): 2011 – 2013
• Project Status: Completed (Fiscal Year 2013)
• Budget Amount: ¥5,330,000 (Direct Cost: ¥4,100,000、Indirect Cost: ¥1,230,000); Fiscal Year 2013: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000); Fiscal Year 2012: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000); Fiscal Year 2011: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
• Keywords: 自然免疫 / 昆虫 / サイトカイン / プロテアーゼ / 微生物

Research Abstract

昆虫が細菌やカビなどの微生物に感染した場合、体液中で液性と細胞性の免疫反応が起こる。ENFペプチドは昆虫サイトカインとして多様な生理活性をもつことが明らかになっており、そのひとつである血球活性化作用は細胞性免疫反応と密接な関係がある。ENFペプチドは普段体液中では不活性なENFペプチド前駆体として存在しており、昆虫が微生物に感染するとENFペプチド前駆体が限定加水分解されて活性化すると考えられている。本研究の目的はこのサイトカイン前駆体の活性化機構を解析し、昆虫の微生物感染に対する細胞性免疫反応と液性免疫反応の連携の分子機構ついて理解を深めることである。研究期間内にカイコのENFペプチド前駆体活性化酵素(pENF processing enzyme;pEPE)の同定、組織における局在性、発現調節機構及び液性免疫系とこの酵素の相互作用について検討した。研究初年度にカイコ血液からのpEPEの精製法を確立し、次年度にはpEPEの構造解析をLC-MS解析及び部分配列解析を行い、cDNAより一次配列情報を得た。また、pEPEの組換え体発現系を確立し、大腸菌発現系から調製した組換え体を抗原としてpEPEに対する特異抗体を得た。さらに昆虫細胞発現系を用いて組換え体pEPEの精製標品を調製に成功した。これらを用いて最終年度にpEPEの局在性と発現様式を調べたところ、pEPEは血球細胞の顆粒細胞と小球細胞の顆粒内に高濃度で存在しており、細菌や真菌の感染により誘導的に発現することが明らかになった。また、pEPEの構造解析からpENE自体がENFペプチドと同様に前駆体として発現していることが明らかになったが、pEPE前駆体の活性化と液性免疫系であるメラニン形成系との連携については否定的な結果を得ており、細菌や真菌の感染からpEPE前駆体の活性化をつなぐ新たな経路の存在を示唆するに至った。

Research Products

• [Journal Article] A low-cost affinity purification system using beta-1,3-glucan recognition protein and curdlan beads (2012)
  • Author(s): Horiuchi, M., Takahasi, K., Kobashigawa, Y., Ochiai, M. and Inagaki, F.
  • Journal Title: PEDS Volume: 25 Issue: 8 Pages: 405-413
  • DOI: 10.1093/protein/gzs028
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Drosophila growth-blocking peptide-like factor mediates acute immune reactions during infectious and non-infectious stress (2012)
  • Author(s): Tsuzuki, S., Ochiai, M., Matsumoto, H., Kurata, S., Ohnishi A., Hayakawa, Y.
  • Journal Title: Sci. Rep. Volume: 2 Issue: 1 Pages: 210-210
  • DOI: 10.1038/srep00210
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A stress-responsive cytokine-like gene regulates insect larval growth (2012)
  • Author(s): Yamaguchi, K., Nomura, S., Matsumoto, H., Tsuzuki, S., Hayakawa, Y.
  • Journal Title: Insect Biochem.Molec.Biol. Volume: 42 Issue: 3 Pages: 183-192
  • DOI: 10.1016/j.ibmb.2011.11.009
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Effect of plasmin treatment on the fibrin gel formation (2011)
  • Author(s): Yatagai,Y., Kubota, K., Toyama,Y., Nameki, N. and Ochiai, M.
  • Journal Title: Trans. Materials Res. Soc. J. Volume: 36 Pages: 371-374
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Mixing effect of deglycosylated fibrinogen on the fibrin polymerization (2011)
  • Author(s): Kubota, K.,Yatagai,Y., Watanabe, N., Fukudal, T., Toyama,Y., Nameki, N. and Ochiai, M.
  • Journal Title: Trans. Materials Res. Soc. J. Volume: 36 Pages: 375-378
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Additive effects of bestaines on the fibrinogen cryogelation induced by low temperature (2011)
  • Author(s): Toyama,Y., Miyamoto, K., Kubota, K.,Wakamatsu, K., Nameki, N., Saheki, T. and Ochiai, M.
  • Journal Title: Trans. Materials Res. Soc. J. Volume: 36 Pages: 393-396
  • Peer Reviewed
• [Presentation] カイコの微生物に対する生体防御機構 (2013)
  • Author(s): 落合 正則
  • Organizer: 第65回日本衛生動物学会大会 病害動物の生理分子生物談話会
  • Place of Presentation: 酪農学園大学(北海道)
  • Invited
• [Presentation] 微生物非感染時に自然免疫を活性化するサイトカイン (2012)
  • Author(s): 落合 正則，都築 誠司、早川 洋一
  • Organizer: 日本動物学会第83回大会
  • Place of Presentation: 大阪大学(大阪)
• [Presentation] ジャコウアゲハの帯糸の黒色化機構の解析 (2012)
  • Author(s): 山中 明、林友 萌子、林 絵里、北沢 千里、落合 正則
  • Organizer: 日本農芸化学会中四国支部大会第34回講演会
  • Place of Presentation: 山口大学(山口)
• [Presentation] エビガラスズメ真皮細胞に存在する色素結合タンパク質凝集成分Xの性状について (2012)
  • Author(s): 間宮 啓史、島田 拓郎、森脇 洋、落合 正則、白井 孝冶
  • Organizer: 日本蚕糸学会支部合同大会
  • Place of Presentation: 信州大学(長野)
• [Presentation] フィブリン重合におけるフィブリノペプチドリリースの解析 (2011)
  • Author(s): 渡辺 直己、窪田 健二、福田 貴宏、谷田貝 祥美、外山 吉治、行木 信一、落合 正則
  • Organizer: 第60回高分子年次大会
  • Place of Presentation: 大阪国際会議場 (大阪)
• [Presentation] フィブリン凝集に対するN-結合糖鎖の部分的切除効果 (2011)
  • Author(s): 福田 貴宏、窪田 健二、渡辺 直己、谷田貝祥美、外山 吉治、行木 信一、落合 正則
  • Organizer: 第60回高分子年次大会
  • Place of Presentation: 大阪国際会議場 (大阪)
• [Presentation] カイコのアポリポホリンIIIによるセクロピン抗菌活性の増強作用 (2011)
  • Author(s): 落合 正則、高橋 洋平
  • Organizer: 日本動物学会第82回大会
  • Place of Presentation: 旭川大雪クリスタルホール (旭川)
• [Presentation] ジャコウアゲハの帯糸の黒色化に関わる因子 (2011)
  • Author(s): 山中 明、林 友萌子、林 絵里、北沢 千里、落合 正則
  • Organizer: 日本動物学会第82回大会
  • Place of Presentation: 旭川大雪クリスタルホール (旭川)
• [Presentation] Activation of the Prophenoloxidase Cascade in Hemocytes of the Locust, Locusta migratoria (2011)
  • Author(s): Ochiai M.
  • Organizer: Sixth International Symposium on Molecular Insect Science
  • Place of Presentation: NH Grand Hotel Krasnapolsky (オランダ)
• [Presentation] Low-cost recombinant protein immobilization and purification system using β-1,3-glucan recognition protein from insect cells (2011)
  • Author(s): 堀内 正隆, 高橋 清大, 落合 正則, 稲垣 冬彦
  • Organizer: 第34回日本分子生物学会
  • Place of Presentation: パシフィコ横浜 (横浜)
• [Remarks]
  • URL: http://www.lowtem.hokudai.ac.jp/insbio/index.html