| Project/Area Number |
23H00100
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Medium-sized Section 14:Plasma science and related fields
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
林 信哉 九州大学, 総合理工学研究院, 教授 (40295019)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
合島 怜央奈 佐賀大学, 医学部附属病院, 講師 (30756143)
山下 佳雄 佐賀大学, 医学部, 教授 (50322300)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2027-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2026)
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| Budget Amount *help |
¥44,720,000 (Direct Cost: ¥34,400,000、Indirect Cost: ¥10,320,000)
Fiscal Year 2026: ¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000)
Fiscal Year 2025: ¥5,590,000 (Direct Cost: ¥4,300,000、Indirect Cost: ¥1,290,000)
Fiscal Year 2024: ¥10,920,000 (Direct Cost: ¥8,400,000、Indirect Cost: ¥2,520,000)
Fiscal Year 2023: ¥23,400,000 (Direct Cost: ¥18,000,000、Indirect Cost: ¥5,400,000)
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| Keywords | プラズマ医療応用 / 大気圧酸素プラズマ / 免疫細胞 / 細胞分化制御 / 酸素プラズマ / アレルギー抑制 / T細胞分化 / Th1/Th2活性 / T細胞マクロファージ協働効果 / M1マクロファージ分化 / 活性酸素種 / 免疫細胞分化 / サイトカイン計測 / 免疫制御 / 液中プラズマ源 / T細胞分化制御 / フローサイトメーター |
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| Outline of Research at the Start |
アレルギー等の免疫疾患は，生体内の数種類の免疫細胞において活性のバランスが崩れることで生じる．従前の対症療法だけでなく，各免疫細胞の活性を通常のレベルに戻し生体の免疫機能を正常化させる方法を見出すことは喫緊の課題である．本研究では，プラズマ照射が免疫細胞の分化を通して免疫活性を制御するメカニズムの解明を行う．特に，T細胞に酸素プラズマを照射した場合に（i）免疫細胞の分化に対する酸素プラズマの作用機序，および（ii）酸素プラズマ照射から細胞分化を経て免疫活性制御に至る反応経路を明らかにすることを目的とする．加えて生体において崩れた免疫バランスがプラズマ照射で正常化することを明らかにする．
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| Outline of Annual Research Achievements |
以下の2項目の研究を行った．
<酸素プラズマ照射からT細胞の分化に至る反応経路の特定>
T細胞に照射する酸素プラズマのCT値が133の場合にCD4＋T細胞からの分化が促進され，サイトカイン計測からTh1およびTh2細胞の活性がともに向上していることが分かった．酸素プラズマ照射から細胞分化や免疫活性化に至る反応経路を遺伝子発現解析により調べた結果，細胞内でグルタチオン代謝およびアルギニン代謝経路が活性化している可能性が得られた．活性酸素によりJNK経路が活性化されmTORシグナル伝達を介したTh1細胞活性が促進されたと考えられる．また，T細胞内でアルギニン代謝が亢進し，アルギナーゼによるポリアミン生合成が向上することで，Th2細胞分化が促進したと考えられる．
<プラズマを照射したT細胞とマクロファージとの協働効果の確認>
生体内では，各種免疫細胞とサイトカインによる高度な免疫システムが形成されている．酸素プラズマ照射によるこの免疫システムの活性制御を目的として，本研究では酸素プラズマを照射したT細胞からのサイトカインのマクロファージへの影響を調べた．オゾン濃度10ppm，照射時間40sのプラズマ照射でマクロファージの食作用が1.6倍まで向上し，マクロファージからのIL-1βの放出量が6.3倍となり，腫瘍の形成を抑制する炎症性マクロファージ（M1）への分化が促進したことが分かった．このとき，細胞内ROSとNOの産生量が増加しており，カスパーゼ1産生が向上したと考えられる．また遺伝子発現解析より，NF-κBの活性化によってproIL-1βが発現しNLR3インフラマソームの形成が示唆された．従って，カスパーゼ1によりpro IL-1βからIL-1βが産生することでM1マクロファージへの分化が促進したと考えられる．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
<酸素プラズマ照射からT細胞の分化に至る反応経路の特定>
本研究項目に関しては以下の通り当初の計画通りに研究を遂行した． 酸素プラズマ照射から細胞分化や免疫活性化に至る反応経路を遺伝子発現解析により調べ，免疫活性化のメカニズムを確認する．マイクロアレイ解析結果より，細胞分化に関わる遺伝子およびTh1, Th2サイトカインの産生に関係する遺伝子を特定し，プラズマによる免疫活性制御の反応経路を明らかにした．
<プラズマを照射したT細胞とマクロファージとの協働効果の確認>
本研究項目に関しては次のように当初の計画以上に進展した． T細胞が主にTh1に分化する場合にはマクロファージの貪食能が向上し，Th2に分化すると抗体産生量が増加する．従って，当初計画に沿ってT細胞とマクロファージとを共培養し，マクロファージ内部に取り込まれた蛍光ビーズをタイムラプス蛍光顕微鏡で観察し蛍光強度からマクロファージの貪食能を調べ，抗体産生量は，ELISA法を用いて定量した．得られた測定結果をプラズマ未照射のT細胞の場合と比較し，免疫システムに最適なプラズマパラメータを見出した．プラズマ照射T細胞からのサイトカインを与えたマクロファージにプラズマを作用させた結果，炎症性M1マクロファージへに分化していることが明らかとなった．加えて，当初計画には無いが重要な，プラズマ照射T細胞サイトカインによるマクロファージのM1分化のメカニズム解明を行った．プラズマ照射によりマクロファージ内部でROS産生が向上しカスパーゼ1が産生され，インフラマソームに作用した結果，M1サイトカインであるIL-1βが生成され，M1分化が促進されたことが初めて明らかとなった．
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は，本プラズマ免疫細胞活性制御法の実用化のための研究を行う．これまで，マクロファージまたはT細胞といった一種類の免疫細胞に対して酸素プラズマを照射することで，各免疫細胞の免疫機能の向上を見出してきた．一方で，実際の体内では数種類の免疫細胞と細胞間情報伝達物質（サイトカイン）が混在した状態である．生体の免疫系にプラズマを適用する場合，プラズマに対する各免疫細胞の異なる応答やプラズマで変性したサイトカインによる各免疫細胞の応答変動などの複雑な相互作用の結果として，マクロファージによる貪食やT細胞による抗体産生等の免疫機能の活性化または抑制が生じる．従って，プラズマによる免疫活性制御法を実用化するためには，血液やリンパ液にプラズマを作用させた場合の免疫細胞の機能活性変化を明らかにする必要がある．生体の免疫系をプラズマにより制御するためには，酸素活性種（プラズマ照射による），各種免疫細胞（サイトカイン放出細胞・感受細胞），各種サイトカインの各要素が存在する免疫システムを考え，これらが相互作用することによる各細胞の免疫機能の変化を評価する必要がある．
今後は，以下の研究項目①～④を設定し研究を遂行する予定である．
研究項目①：【免疫細胞基礎特性】酸素プラズマを照射した免疫細胞のサイトカイン感受性の変化，およびプラズマを照射したサイトカインによる細胞間信号伝達の変化を調べる．
研究項目②：【免疫システム活性化】各種免疫細胞とサイトカインで構成される免疫システムに酸素プラズマが作用した際の免疫活性の変化を評価する．
研究項目③：【メカニズム探索】酸素プラズマ照射から免疫システム活性化に至る反応経路およびメカニズムを明らかにする．
研究項目④：【実用化検討】生体のリンパ液等に酸素プラズマを照射することで，生体の免疫活性制御が可能であることを確認し，アレルギー治療や予防医療への可能性を検討する．
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