| Project/Area Number |
23H00317
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Medium-sized Section 37:Biomolecular chemistry and related fields
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
岡本 晃充 東京大学, 大学院工学系研究科(工学部), 教授 (60314233)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大橋 瑠子 新潟大学, 医歯学系, 教授 (20447600)
森廣 邦彦 東京大学, 大学院工学系研究科(工学部), 准教授 (70713890)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2025)
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| Budget Amount *help |
¥47,970,000 (Direct Cost: ¥36,900,000、Indirect Cost: ¥11,070,000)
Fiscal Year 2025: ¥10,920,000 (Direct Cost: ¥8,400,000、Indirect Cost: ¥2,520,000)
Fiscal Year 2024: ¥10,920,000 (Direct Cost: ¥8,400,000、Indirect Cost: ¥2,520,000)
Fiscal Year 2023: ¥26,130,000 (Direct Cost: ¥20,100,000、Indirect Cost: ¥6,030,000)
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| Keywords | 核酸 / 化学合成 / 集合体 / ハイブリダイゼーション / マイクロRNA / 核酸集合体 / ユビキチン |
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| Outline of Research at the Start |
我々は、核酸連続集合体形成を引き起こす化学合成短鎖ヘアピン核酸対「がん溶解性ヘアピン核酸対（oHPs）」を細胞内へ導入すると強力な細胞毒性を引き起こす場合があるという予備データを得た。本研究では、人工核酸によるタンパク質との複合体構造が引き起こす２つの異なるタイプの細胞機能誘導、①oncomiRをトリガーにした合成核酸連続集合体形成がもたらす免疫惹起メカニズムとその応用、②合成ユビキチン化ヘアピン核酸を介した標的タンパク質の間接的ユビキチン化と選択的プロテオリシス誘導を題材とする。精密設計人工合成核酸によって引き起こされる細胞内分子メカニズムを解明し、新規薬剤設計への応用を提案する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は、oHPs-cGAS複合体構造がcGAS-STING経路の作動によってI型インターフェロン産生を引き起こすと想定し、その実証実験を進めた。miR-21を標的にしたoHPsをHeLa細胞やMBA-MD-231細胞にトランスフェクションして、RT-PCRによりIFN-βの発現を解析した。oHPs片方だけのトランスフェクションではIFN-βの発現は誘導されないが、oHPs両方をトランスフェクションするとIFN-βの発現が誘導され、cGAS-STING経路仮説が実証された。
また、oHPs-cGAS複合体構造の化学が我々の考え通りに免疫を誘導することを具体的な事例として示すために、トリプルネガティブ乳がん（TNBC）で過剰発現するoncomiR（miR-21）をトリガーにしたoHPs集合体形成を検討した。TNBC細胞（MDA-MB-23）を用いた実験で細胞死が上述のようにIFN-βが生じることによって引き起こされた。現在ヒト化免疫不全マウスに対してTNBCの移植を試みている。
また、合成したユビキチン化核酸（UbiNa）が標的タンパク質（NF-kB）と十分な複合体を形成できることをゲル電気泳動で確認した。また、分子モデリングにより、タンパク質にあたかも直接ユビキチンが結合したかの構造を間接的ユビキチン化複合体（UbiNa-NF-kB複合体）が有していることを確認した。さらに、結合タンパク質がプロテアソームで分解されることを26Sプロテアソームを用いて確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の予定通り進捗している。乳がん移植マウスのの構築に手間取っているものの、化学合成や効果の評価については順調に進んでいる。第2年度分の研究を先取りして進んでいる部分もある。
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| Strategy for Future Research Activity |
ヒト化免疫不全マウスへTNBCを移植してoHPs投与によるTNBC組織の成長抑制の検討を進める。免疫系の惹起は腫瘤切片を病理解析することによって判断する。特に、アポトーシス発生後にがん組織に集まってくる免疫細胞の活動を観察することは、oHPs投与によるオンコリシスの効果を理解するうえで重要である。また、oHP投与TNBC細胞とマクロファージとの動的な相互作用を、我々独自に開発した一細胞相互作用プラットフォームを用いて効果の時間経過を観察して、oHP投与によるオンコリシスとがん免疫惹起効果を可視化する。また、oHPs投与について現在用いているDDSが効率的ではないことが判明したため、代替のDDSを探索・開発して、それを用いたoHPs投与法を検討する。
UbiNaの特徴はその構造が非ユビキチン化タンパク質のプロテアソーム分解を誘導するところにあり、UbiNaがどのくらい触媒回転するかについて、標的タンパク質の分解実験を通して数値化する。UbiNaの劣化は、脱ユビキチン化酵素の働きによる核酸－ユビキチン連結部位の分解に起因すると予想され、これを試験管内実験で検証する。脱ユビキチン化酵素耐性を持たせるためのユビキチンC末端のアミノ酸配列置換について最適化を進める。リポフェクションによってMCF-7細胞などNF-kBが活発に発現する細胞にUbiNaを導入する（UbiNaの細胞導入法は確立済み）。NF-kBはTNF-βによるアポトーシス誘導を抑制することが知られており、UbiNaの導入によるNF-kBのノックダウンにより、MCF-7細胞のアポトーシスが引き起こされることが期待される。MCF-7細胞へのUbiNa添加後にTNF-βを加えて、細胞生存率の変化をモニターする。UbiNaの有効性が認められれば、担がんマウスへの局注を行い、がん増殖抑制効果が現れるかについて検討する。
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