| Project/Area Number |
23H00324
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Medium-sized Section 38:Agricultural chemistry and related fields
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
榊原 均 名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (20242852)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
小嶋 美紀子 国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 技師 (10634678)
西川 俊夫 名古屋大学, 生命農学研究科, 教授 (90208158)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2027-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2025)
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| Budget Amount *help |
¥46,930,000 (Direct Cost: ¥36,100,000、Indirect Cost: ¥10,830,000)
Fiscal Year 2025: ¥10,400,000 (Direct Cost: ¥8,000,000、Indirect Cost: ¥2,400,000)
Fiscal Year 2024: ¥10,790,000 (Direct Cost: ¥8,300,000、Indirect Cost: ¥2,490,000)
Fiscal Year 2023: ¥14,300,000 (Direct Cost: ¥11,000,000、Indirect Cost: ¥3,300,000)
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| Keywords | サイトカイニン / 植物病原菌 / FASオペロン / Rhodococcus fascians / ジャガイモそうか病菌 |
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| Outline of Research at the Start |
植物ホルモンの１つであるサイトカイニンの作用は、濃度変化による「量的」な調節と側鎖構造の多様性による「質的」な調節により、その強さと制御形質が規定される。ある種の植物病原菌では、その病症原因遺伝子座にコードされる酵素群が特殊な側鎖修飾をもつサイトカイニン様分子群を生産し、それらが宿主植物の情報統御の恒常性を撹乱することで奇形を誘発する。そこで本研究では、植物病原菌が作り出す新奇サイトカイニン様分子群の構造とその生合成機構と作用機作を分子レベルで解き明かし、病原微生物由来のサイトカイニン側鎖構造の多様性と質的な作用調節機構の基盤原理を明らかにする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
P450酵素であるFAS１の組換え酵素タンパク質を用いたin vitroでの反応産物の分析から、FAS1が単なる水酸基付与ではなく複数段階の酸化反応を触媒し、分子質量305の中間産物（NC305）を経て、分子質量303の化合物（NC303）を生成することを突き止めた。
そこで、研究分担者の西川教授との共同によりNC305の構造を推定し、チオールなどの化学修飾反応実験を行うことで、この推定構造に矛盾がないことを確かめた。さらに西川教授の協力のもとで、NC305の有機化学合成を行った。NC305とFAS1との反応性、および反応産物とNC303との同一性を検証したところ、当初反応性はないことを示唆する結果を得た。しかしその後の検証で、有機合成NC305は合成過程の溶液環境により予想外の構造変化を起こしていることが判明し、NC305の構造推定は正しいことを確信するに至った。
Rhodococcus erythropolisを用いた大量培養系を用いて、NC303の大量生産と精製を試みた。R. erythropolisによりNCは大量に合成されていると予想されたが、NC303は植物内在性サイトカイニンやNC289までのFASオペロン産物に比べ、溶媒抽出における挙動が大きく変わり、通常の精製法の適用ができないことが判明した。
一方、中間生成物として感染植物内に蓄積されるNC273のグリーンカルスアッセイにおける強いシュート誘導活性について、シロイヌナズナ野生型とサイトカイニン受容体変異体ahk4およびahk2ahk3の胚軸を用いたグリーンカルスアッセイを行ったところ、ahk4変異体では、NC273依存的なグリーンカルス生成や、根の伸長阻害がほぼ完全にキャンセルされたことから、NC273はAHK4を介して作用していることが強く示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
FASオペロンを持つR. fasciansとS. turgidiscabies両方のFAS1組換え酵素タンパク質を精製することに成功し、in vitroでの反応産物の分析が可能となった。その結果、FAS1がNC289を基質とし、分子質量305の中間産物（NC305）を経て、分子質量303の化合物（NC303）を生成することを突き止め、さらにNC305の分子構造をほぼ特定できたことは、本研究を大きく前進させる成果である。NC305の有機合成も当初の想定を超えて複雑で困難を極めたが、その方法を確立できたことから、当初の目標をほぼ達成しているといえる。
Rhodococcus erythropolisを用いた大量培養系では、当初容易に最終産物のNC303の精製が可能であると予想したが、NC303は溶媒抽出における挙動が大きく変わり、通常の精製法の適用ができないことが判明した。この手法は条件設定の段階で滞っているが、上述の手法で合成したNC303も同様の挙動を示すことが判明したことから、私たちの予測構造の正しさを示す傍証にもなった。精製法については今後さらに検討を進める計画である。
中間生成物であるNC273がもつ強いシュート誘導活性について、AHK4を介して作用していることが明らかにできた。これはNC化合物のうち、少なくともNC273まではサイトカイニンとしての作用を持つことを示すことができた成果でもあり、NC化合物全体の作用様式を考える上で重要な知見となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
2025年度は、ほぼ合成の目処がたったNC305の有機合成を完成させるとともに、それを用いたFAS1との反応産物の分析を行い、最終産物（NC303）の化学構造を決定する。質量分析は研究分担者の小嶋、中間産物の化学合成とNMR解析は西川の協力を得て行う。
これと並行し、FAS1酵素タンパク質の大量精製を行い、X線結晶構造解析を試みる。NC273, NC289, NC305などとの共結晶を得たうえで、それらの結晶構造を解くことで、FAS1の多段階反応機構を構造生物学的に理解する。
上記の実験と並行し、Rodococcus属細菌発現ベクターを導入したRhodococcus erythropolisの大量培養系も引き続き利用し最終産物の精製を行い、上記の実験結果との符号を確認する。
またこれまでの研究で、中間生成物として感染植物内に蓄積されるNC273のグリーンカルスアッセイにおける強いシュート誘導活性について、サイトカイニン受容体の１つAHK4を介した情報伝達に依存することが判明したため、分子動態シミュレーションを用いて、見かけ上親和性が低いNC273がAHK4のリガンドポケットに収容された後の結合状態の安定性について、内生サイトカイニンとの比較解析を行う。
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