| Project/Area Number |
23H00325
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Medium-sized Section 38:Agricultural chemistry and related fields
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| Research Institution | Doshisha University (2024-2025)
Kyoto University (2023) |
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Principal Investigator |
入江 一浩 同志社大学, 研究開発推進機構, 嘱託研究員 (00168535)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
久米 利明 富山大学, 学術研究部薬学・和漢系, 教授 (10303843)
池川 雅哉 同志社大学, 生命医科学部, 教授 (60381943)
喜田 昭子 京都大学, 複合原子力科学研究所, 助教 (70273430)
塚野 千尋 京都大学, 農学研究科, 教授 (70524255)
景山 裕介 滋賀医科大学, 医学部, 医員 (80971069)
遠山 育夫 滋賀医科大学, 医学部, 理事 (20207533)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2025)
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| Budget Amount *help |
¥47,190,000 (Direct Cost: ¥36,300,000、Indirect Cost: ¥10,890,000)
Fiscal Year 2025: ¥14,560,000 (Direct Cost: ¥11,200,000、Indirect Cost: ¥3,360,000)
Fiscal Year 2024: ¥15,600,000 (Direct Cost: ¥12,000,000、Indirect Cost: ¥3,600,000)
Fiscal Year 2023: ¥17,030,000 (Direct Cost: ¥13,100,000、Indirect Cost: ¥3,930,000)
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| Keywords | アルツハイマー病 / アミロイドβ / 抗Aβ42毒性配座特異抗体 / 毒性オリゴマー / 分子内ジスルフィド結合 / 脳脊髄液 / 抗毒性ターン体 / ジスルフィド結合 / オリゴマー / 抗毒性ターン特異抗体 / 毒性立体配座 / 抗毒性ターン抗体 / 有機化学 / 毒性配座特異抗体 |
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| Outline of Research at the Start |
本研究代表者らは、42残基のアミロイドβタンパク質が中央部分でターン構造を取ることによって毒性オリゴマーを形成するという「毒性配座理論」を提唱し、本理論に基づき、分子内SS架橋により毒性配座に固定したAβ42と、C末端領域でAβを架橋した毒性2および3量体モデルを創製してきた。本研究ではこれらに対するモノクローナル抗体を作製し、得られた抗体と抗原との共結晶のＸ線構造解析、並びに各種機能解析を行う。次に、毒性配座を適切に認識する抗体を選別し、N末抗体とのサンドイッチELISAを構築して、ヒト脳脊髄液ならびに血漿による超早期AD診断法を確立する。さらに、これらの抗体によるADモデルマウスに対する治療効果を検証する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
アルツハイマー病（AD）の発症において重要な役割を果たしているアミロイドβ（Aβ）は，凝集により細胞毒性を示す．本研究代表者らは，Aβ42が中央部分でターン構造を取ることによって，C末端に疎水性コアが形成され，毒性オリゴマーになるという「毒性配座理論」を提唱した．本研究は，毒性配座に固定したAβ42およびその2量体モデルに対する抗体を作製し，ヒト血漿ならびに脳脊髄液による超早期AD診断法の確立を目的としている．
今年度は，以前Aβ42の17, 28位間の分子内ジスルフィド架橋体（L17C,K28C-SS-Aβ42）を抗原として作製した抗毒性ターン特異抗体・TxCo-1とE22P-Aβ9-35を抗原として作製したN末抗体・11A1（Tyr10-His14を認識）を用いて，ADならびにnon-AD剖検脳の免疫組織化学的染色を行った．その結果，TxCo-1はAD患者の大脳皮質中の老人斑を選択的に認識したのに対して，11A1はAD患者の老人斑のみならずnon-AD患者の大脳皮質，ニューロン，アストロサイト中のAβ凝集体にも反応した．これより，毒性ターン構造をエピトープとするTxCo-1抗体は，AD病態に密接に関連するAβ凝集体を検出できることが明らかになった．そこで，TxCo-1と市販のN末抗体・82E1とのサンドイッチELISAを作製し，ヒト血漿中の毒性配座を持つAβを定量した（筑波大・冨所博士，斉木教授との共同研究）．その結果，毒性配座を持つAβとAβ42との量比が，AD群においてnon-AD群よりも有意に高いことが判明した．
毒性配座に固定した新しいAβ42誘導体を得るため，Lys28のアミノ基とAla42のカルボキシラートとの分子内イオン結合を，ジスルフィド結合で模倣したK28C,A42C-SS-Aβ42を合成したところ，Aβ42の生理的濃度（1 nM）でTHP-1細胞に対して有意な毒性を示した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
Aβ42の毒性ターンを直接固定したL17C,K28C-SS-Aβ42を抗原として作製したTxCo-1抗体が，AD病態に関連するAβ42凝集体と選択的に反応するとともに，市販のN末抗体とのサンドイッチELISAでヒト血漿を分析することにより，AD診断可能であることが示唆された．抗毒性ターン抗体のヒト血漿でのデータはこれが初めてである．これより，「Aβ42の毒性ターン構造を標的とする抗体はADの診断薬・治療薬になりうる」という作業仮設が一部実証された。
これまでAβ42の22, 23位での毒性ターン構造を，左右から挟むようにして分子内ジスルフィド架橋することにより固定してきた（直接固定）． その結果最適化されたL17C,K28C-SS-Aβ42は，野生型Aβ42よりも1オーダー低い濃度で細胞毒性（SH-SY5Y, THP-1細胞）を示した．それに対して，in vitroで作製されたAβ42凝集体（フィブリル）中に見られるLys28のアミノ基とAla42のカルボキシラートとの分子内イオン結合を，ジスルフィド結合で模倣することにより，22, 23位の毒性ターンをより自然な状態で固定することに成功した（間接固定）．配座固定誘導体の一つであるK28C,A42C-SS-Aβ42は，溶解直後からβ-シートリッチなオリゴマーとして存在するとともに，特にTHP-1細胞に対する毒性は高く，Aβ42の生理的濃度（1 nM）でも有意な毒性を示した．K28C,A42C-SS-Aβ42は革新的な毒性配座固定化合物であり，この毒性配座に特異的に結合する抗体は新規AD診断薬・治療薬シードになることが期待される．
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| Strategy for Future Research Activity |
Aβ42の生理的な濃度で顕著な細胞毒性を示したK28C,A42C-SS-Aβ42を，マウスあるいはラットに免疫することにより，そのC末端領域の立体配座を特異的に認識する抗体の作製を試みる．得られた抗体については，AD患者剖検脳に対する免疫組織化学的染色を実施し，AD病態と相関性の高い抗体を選別する．
昨年度に引き続き，E22P変異体ではなく野生型の配列をもつAβ42の高毒性2量体モデルを開発するため，C末端領域における架橋位置を系統的に変えた各種2量体モデルを合成し，構造機能解析を行う．Aβ42の毒性を遥かに凌ぐ2量体モデルが得られた場合，C末端領域の立体配座を特異的に認識する抗体を作製する．
昨年度より，抗毒性ターン抗体・TxCo-1によるADモデルマウスの治療実験を開始した．現在実験動物の数を増やしており，2025年度中に治療実験を完了できるように進める．
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