| Project/Area Number |
23H00367
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Medium-sized Section 43:Biology at molecular to cellular levels, and related fields
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
真下 知士 東京大学, 医科学研究所, 教授 (80397554)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
吉見 一人 東京大学, 医科学研究所, 准教授 (50709813)
石田 紗恵子 東京大学, 医科学研究所, 助教 (50777927)
竹下 浩平 国立研究開発法人理化学研究所, 放射光科学研究センター, 研究員 (80346808)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2028-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥46,410,000 (Direct Cost: ¥35,700,000、Indirect Cost: ¥10,710,000)
Fiscal Year 2024: ¥9,100,000 (Direct Cost: ¥7,000,000、Indirect Cost: ¥2,100,000)
Fiscal Year 2023: ¥10,010,000 (Direct Cost: ¥7,700,000、Indirect Cost: ¥2,310,000)
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| Keywords | CRISPR-Cas3 / in vitroゲノム編集 / in vivoゲノム編 / 核酸検出法 / モデル動物 / ゲノム編集 / 原子間力顕微鏡 / コラテラル切断 / 受精卵 / 遺伝子改変マウス / 脂質ナノ粒子 / 診断薬 / in vivoゲノム編集 / マウス |
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| Outline of Research at the Start |
我々は世界で初めてCRISPR-Cas3システムを用いて、真核細胞におけるゲノム編集に成功した。「ハサミ」のようなCas9と異なり、Cas3は「シュレッダー」のように数キロに渡る大きな欠失変異を導入する。一方、Cas3には欠失範囲の制御などいくつかの課題が存在する。本研究では１）Cas3独自のゲノム編集メカニズムの解明、２）ヒトHEK細胞、iPS細胞等での効率的なゲノム編集、３）マウス受精卵編集および体細胞ゲノム編集、４）感染症診断等の核酸検出CONAN法の開発を行う。新しく開発された様々なCRISPR-Cas3ゲノム編集法は、基礎研究、モデル動物、診断薬、遺伝子治療等の発展に寄与する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
１～４)の研究テーマに沿って、CRISPR-Cas3ゲノム編集メカニズムの解明、細胞、受精卵、動物個体でのゲノム編集効率の向上と改善、新規ゲノム編集技術の開発を行った。新しく開発された様々なCRISPR-Cas3ゲノム編集法は、基礎研究、モデル動物、診断薬、遺伝子治療等の発展に寄与する。
１）CRISPR-Cas3ゲノム編集／DNA修復メカニズムの解明：Octetバイオレイヤー干渉法および高速原子間力顕微鏡HS-AFMにより、Cas3による二本鎖DNA切断する瞬間をとらえ、ヘリカーゼ活性によるリール（巻取り）およびループ構造の形成、コラテラル切断を利用した大規模ゲノム欠失メカニズム（インターフェアランス）を解明した。
２）様々な細胞におけるCas3ゲノム編集：ヒトHEK細胞、ヒトプライマリーT細胞、ヒト造血幹細胞、およびiPS細胞等において、プラスミドおよびタンパク質導入によるCas3ゲノム編集を実施して、FACSおよびデジタルPCRにより10－70％のゲノム編集効率を得ることができた。
３）モデル動物におけるin vivoゲノム編集：受精卵にCas3 修飾mRNA/crRNAを導入することで、10－40％の高率で標的遺伝子ノックアウトマウス・ラット作製に成功した。Cas3-修飾mRNA/crRNAを内包した脂質ナノ粒子LNPにより、マウスで尾静注により肝臓での10－50％のin vivo編集に成功した。
４）感染症診断や遺伝子診断に利用する新しい核酸検出法CONAN：PCRでの増幅では難しい数百の繰返し配列（リピート病）について、繰返し配列特異的crRNAにより、定量性のある診断法および迅速遺伝診断スクリーニング法を開発した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画通り１～４)の研究テーマに沿って、以下の通りCRISPR-Cas3ゲノム編集メカニズムの解明、細胞、受精卵、動物個体でのゲノム編集効率の向上と改善、新規ゲノム編集技術の開発を行うことができたために、（２）おおむね順調に評価していると自己評価する。
１）CRISPR-Cas3ゲノム編集／DNA修復メカニズムの解明：CRISPR-Cas3による二本鎖DNA切断の切断する瞬間を世界で初めてとらえることに成功した。各種Cas蛋白を別々に精製することに成功し、分子間相互作用等の解析やcrRNAと混ぜることでin vitroおよびin vivoでゲノム編集することに成功して、特許申請の準備を行っている。
２）様々な細胞におけるCas3ゲノム編集：ヒトHEK細胞、Jurkatリンパ球細胞、ヒト造血幹細胞、およびiPS細胞等において、divided-in-two (Dit)プラスミドあるいは上述Cas3リコンビナントタンパク質を利用することで、各種細胞でエレクトロポレーション、培地条件などを検討することで、効率的なCas3ゲノム編集プロトコールを作成することができた（論文準備中）。
３）モデル動物におけるin vivoゲノム編集：修飾mRNA/crRNAを利用することで、マウス・ラット受精卵にCas3導入することで、効率的な標的遺伝子ノックアウト動物の作成を行うことができた（論文投稿中）。Cas3-修飾mRNA/crRNAを内包した脂質ナノ粒子LNPにより、マウスで尾静注により肝臓での効率的なin vivo編集に成功することができた（論文準備中）。
４）感染症診断や遺伝子診断に利用する新しい核酸検出法CONAN：数百から数千の繰返し配列について、繰返し配列特異的crRNAをデザインすることで、定量性のある診断法を開発することに成功した（論文投稿中）。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後も引き続き、１～４)の研究テーマに沿って、CRISPR-Cas3ゲノム編集メカニズムの解明、細胞、受精卵、動物個体でのゲノム編集効率の向上と改善を行う。
１）CRISPR-Cas3ゲノム編集／DNA修復メカニズムの解明：各種Cas蛋白の精製、分子間相互作用等によりCascade/Cas3/crRNAがどのように形成されるかプロセシングメカニズムの解明を目指す。タイプⅠCRISPRに利用される新規Casトランスポゾン等を利用して、ヒト細胞における効率的な遺伝子改変およびノックインを目指す。
２）様々な細胞におけるCas3ゲノム編集：ヒトHEK細胞、造血幹細胞、iPS細胞等において、mRNA導入によるゲノム編集を実施する。crRNA導入方法、サイズ、修飾等を検討する。FACS、Amplicon-seq、デジタルPCRによりノックアウト効率、ドナーDNAを用いたノックイン効率の向上を目指す。
３）モデル動物におけるin vivoゲノム編集：マウス受精卵においてCas3 RNP, mRNAを用いてさらにゲノム編集を実施する。修飾crRNA、ゲノム編集エンハンサーあるいはDNA修復機構の改善により、受精卵における効率的なCas3ゲノム編集を目指す。Cas9-mRNAを内包した脂質ナノ粒子LNPにより、ヒト細胞でCas3ゲノム編集を行う。マウスで尾静注、筋注によりさらに肝臓、筋肉細胞でのin vivo編集を試みる。
４）感染症診断や遺伝子診断に利用する新しい核酸検出法CONAN：CONANを利用して、新型コロナおよびインフルエンザ同時診断法を開発する。PCRでの増幅では難しい数百の繰返し配列（リピート病）について、繰返し配列特異的crRNAにより、簡便、迅速遺伝診断スクリーニング法のさらなる開発を目指す。
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