質量分析リン酸化プロテオーム用いた微量タンパク質修飾部位の検討

• Project/Area Number: 23H05248
• Research Category: Grant-in-Aid for Encouragement of Scientists
• Allocation Type: Single-year Grants
• Review Section: 3120:Biology at molecular to cellular levels, biology at cellular to organismal levels, biology at organismal to population levels and anthropology, neuroscience and related fields
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 谷 直紀 熊本大学, 技術部, 技術専門職員
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2024-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥480,000 (Direct Cost: ¥480,000); Fiscal Year 2023: ¥480,000 (Direct Cost: ¥480,000)
• Keywords: 質量分析 / リン酸化ペプチド / プロテオミクス

Outline of Research at the Start

質量分析計の高感度・高性能・高速化により僅かなサンプルでも測定解析が可能となり、転写・翻訳後タンパク質による生体調節機能や動的性質にスポットライトが当てられ、タンパク質の翻訳後修飾による調節機構を解明する研究が盛んに行なわれている。リン酸化のごく微量な変化が生体の調節機構に深く関わっていることが多く、本研究では試料中のごく微量なリン酸化ペプチドを効率的・選択的に測定し、実践的な測定解析の限界を評価したい。

Outline of Annual Research Achievements

【研究目的】
質量分析計の高感度・高性能・高速化により僅かなサンプルでも測定解析が可能となり、転写・翻訳後タンパク質による生体の調節機能や動的性質にスポットライトが当てられ、タンパク質の翻訳後修飾による調節機構を解明する研究が盛んに行われている。特にリン酸化修飾ではごく微量な変化が生体の調節機構に深く関わっていることが多く、これまでの研究課題に引き続き、本研究では微量なリン酸化ペプチドを効率的・選択的に測定し、検出から機能タンパク質の解析限界を評価する。
【研究方法】
微量なリン酸化ペプチドを効率的・選択的に測定の評価を行う。市販HeLa細胞由来のトリプシン消化物（Pierce HeLa Protein Digest Standard）を用いてリン酸化ペプチド精製・クリーンアップキットを用いた実験を進める一方、実際の生体試料を用いてごく微量なリン酸化ペプチドの実践的な測定解析を試みる。
【研究成果】
これまで翻訳後修飾の解析では大量のサンプルを投入する必要があり、カラムの試料負荷量が最大に近い投入が必要であった。本研究では、数時間単位の分離溶出グラジエント適用とリン酸化ペプチド精製・クリーンアップキット用いた調製を適宜併用し、生体試料中からのごく微量なリン酸化ペプチドの実践的な測定解析を試みた。リン酸化ペプチド精製ステップを加えた方がタンパク質への比較評価が良好であった。微量タンパク質の限界についてまで評価できなかったため、引き続き、微量タンパク質の評価を目指し、今後も実験を継続して行く予定である。