| Project/Area Number |
23K03832
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 21010:Power engineering-related
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| Research Institution | Ariake National College of Technology |
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Principal Investigator |
河野 晋 有明工業高等専門学校, 創造工学科, 教授 (30270375)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
冨永 伸明 有明工業高等専門学校, 創造工学科, 教授 (30227631)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,080,000 (Direct Cost: ¥1,600,000、Indirect Cost: ¥480,000)
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| Keywords | エレクトロポレーション / マルチパルス / メダカ / ゼブラフィッシュ / 魚類受精卵 / エレクトロポレーター / 物質導入 |
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| Outline of Research at the Start |
エレクトロポレーション法（電気穿孔法，EP法）とは，電気パルスを細胞に印加することで細胞膜に一時的な孔を形成しそこから物質を導入する技術である。
本研究では，魚類受精卵を対象として実験を行う。細胞と異なり，卵膜で取り囲まれている魚類受精卵内の胚細胞に外部から物質を導入するには，①まず受精卵の外膜である卵膜に孔をあけ，②そこから化学物質や遺伝子を導入し，③遺伝子の場合，さらに胚細胞に取り込ませる，ということが必要となる。
本研究は，これらの実現を目指して複数の電圧パルスによる新しいマルチパルスEP法を確立することを目的とする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
初めに，マルチパルスEP装置を用いて，魚類受精卵（メダカ，ゼブラフィッシュ）に対し電気パルスによるダメージの調査を行った。パルス幅と電圧を変化した電気パルスを溶液内の受精卵に印可し生存率と死亡率を調べた。実験結果より，メダカ受精卵は100 ns,2.0 kV，インターバル100 ms，3 ms,20 V，ゼブラフィッシュ受精卵は100 ns,800 V，インターバル100 ms，3 ms,20 Vを導入実験で用いるそれぞれの基本パルス条件とした。
導入実験では，分子量5k,60k,150k,500kDaの蛍光標識デキストランを溶かしたものをパルス印可時の周囲溶液として使用した。周囲溶液で満たした自作のキュベットに受精卵１個配置しパルス印可した。その後，蛍光顕微鏡を用いて，通常の蛍光視野画像および断面画像（顕微鏡付属のセクショニング機能）を観察した。
ゼブラフィッシュ受精卵に対する実験では，受精卵内部の断面画像および卵膜を破いて採取した卵内液（囲卵腔液）の蛍光画像から，パルス印可が無い場合5kや60kDaのデキストランは卵内に導入され，150kや500kDaは導入されないこと，一方パルス印可をすることで150kや500kDaも卵内に導入されることが分かった。
メダカ受精卵に対する実験では，断面画像では卵膜に付着したデキストランの発光が強く囲卵腔液からの発光との区別がつかず，さらに卵膜が強固で破くことができなかったため囲卵腔液だけの発光も未確認であり今後の検討が必要である。
実験と並行して，新型の高速大容量の半導体素子を用いたパルス発生装置を試作した。ナノ秒パルス発生に使用してきた従来のパルス形成線路型パルス発生器における問題の一つであるパルス幅を容易に変えられることに加え，負荷とのミスマッチに起因する出力電圧の変動がなくなることから，実験の効率の向上が期待できる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
年度内の早い時期にゼブラフィッシュの飼育環境が整ったこともあり，メダカ受精卵とゼブラフィッシュ受精卵の両方に対する蛍光標識デキストランの導入実験を開始できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
卵膜が堅牢で膜上に付着したデキストランの発光強度が強いため導入可否が判明していないメダカ受精卵について導入判定手段について検討する。
マルチパルス印可の有無と異なるサイズのデキストラン導入の可否の関係について引き続き調査する。
同様の実験をパルス条件を拡大して行い，電気ダメージや導入量（発光強度）の変化を調査する。
GFPの導入実験を開始する。
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