| Project/Area Number |
23K04796
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 34020:Analytical chemistry-related
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| Research Institution | Suzuka University of Medical Science |
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Principal Investigator |
森本 正大 鈴鹿医療科学大学, 薬学部, 助教 (90824772)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2027-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2026: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2023: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
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| Keywords | プロテオミクス / ケミカルバイオロジー / 分析化学 / 有機化学 |
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| Outline of Research at the Start |
長寿命型タンパク質は、経時的（加齢）および酸素や紫外線などの影響により構造変化を起こして蓄積されていく。この構造変化のうちアミノ酸残基レベルでの化学反応として、L-Asp残基のD-化やiso化が知られている。特定タンパク質では異性化が報告されている一方、タンパク質中の全てのAsp残基において異性化するわけではないため、ほとんどのタンパク質における異性化の有無については未解明である。本研究は、この異性化アミノ酸を含むタンパク質種を網羅的に同定・解析することが可能となる新たな解析手法を開発することを目的としている。この解析手法を単体のモデル系から最終的にはヒト生体サンプルに順次適用・実証していく。
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| Outline of Annual Research Achievements |
長寿命型タンパク質の老化現象として考えられている生体内アミノ残基のD-異性化現象について、我々は新規に考案した異性化修復酵素PIMTと異性化反応の中間体である環状構造と反応する化学プローブを組み合わせた新規ケミカルラベリング技術の開発を行ってきた。
この技術について、すでに異性化アミノ酸を持つ合成モデルペプチドを対象としたラベル反応を確認し、最適な反応条件やMS解析結果から新たに判明した切断付加反応のような副次的反応についても詳細を明らかにしてきた。
今回、我々は新たに既報のタンパク質に異性化部位（D-化、iso化）を生じさせる技術を用いて、リゾチーム、チキンアルブミン、カルモジュリン、α‐クリスタリンなどのすでに異性化することが分かっているタンパク質類に対して行い、モデル異性化タンパク質の作成に成功した。特に、リゾチームとチキンアルブミンにおいては、PIMT共存下での化学プローブとの反応を確認しており、電気泳動およびウェスタンブロッティングによる化学発光検出実験を行って、ラベル化反応物の確認に成功した。さらには、アルブミンにおいては切断反応物の確認にも成功している。
以上の結果を持って、モデルタンパク質における化学発光検出が可能となったため、チキンの脳細胞をライセート化したサンプルを新たに調整、この異性化部位を生じさせるプロセス（エイジング）を行って、エイジング前のサンプルをコントロールとし、エイジングサンプルに対してラベル化を行って新規に化学発光検出されるバンドを複数発見した。また、そのうち一種がチキンアルブミンであると同定に成功した。他のバンドについては現在解析中であるが、人工的な混合系においても解析が可能であると分かったため、現在は老齢マウス（週齢140週↑）を飼育し、生体において自然な形で発生する、加齢性タンパク質を含む脳内タンパク質のサンプル化を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
現段階において、本ラベル化技術をペプチド、モデル単体タンパク質、そして細胞抽出ライセートと様々な系に応用・展開してきた。特にこのチキン脳から抽出してきたライセートにエイジング処理を施したモデル系の開発に成功した。この複雑系のモデル系は、人工的な処理により、異性化残基を作ることが可能であり、既知・未知の異性化タンパク質が存在する。人工的処理により異性化しやすい残基を強制的に異性化するため、本来自然的に発生する異性化タンパク質以外も異性化してしまうという欠点があるものの、異性化タンパク質を探索するためのモデル系としては非常に有用である。
本年度の実験においては、まずはこのモデル系ライセートを作成するために様々なエイジング条件（温度:40℃～50℃、pH：4.0～6.0、時間：3日～14日）を探索し、開発に成功した。これらのエイジング処理プロセスは論文で過去に報告されていたものを参考に、タンパク質の凝集によるロス、分解によるロスなどを抑えながら長期間の過激な条件に置いておき、異性化を誘発させるというものである。
このモデル系の作成に成功したことにより、ラベル化技術を本ライセートサンプルに適用する実験を行うことが出来た。ラベル化実験としては、エイジング前のライセートサンプルをコントロールとし、エイジング後のライセートに対してラベル化、ビオチン‐アビジン系を用いた化学発光検出により、ラベル化由来のバンドを解析した。この結果、エイジングサンプルとコントロールを比較し、新規に化学発光検出されたタンパク質が複数存在することがわかった。また、アルブミン抗体を用いた検出実験を行った結果と対比することで異性化したタンパク質の1種類がアルブミン由来であることがわかった。
これらの結果から、本ラベル化技術の検証例を明示することが可能となり、本研究計画が順当に進捗しているといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究においては、二つの実験計画でもって、進行していく。
一つ目は、進捗項目において報告した人工異性化ライセートモデル系を用いて、プローブとの結合条件やラベル化条件の最適化を行っていく。報告事項にもあるラベル化バンドの解析は最適条件で行ったわけではないことが分かっており（ラベル効率の低下など）、ラベル化効率が悪いと考えられるため、高濃度化やラベル条件である温度・濃度・時間などの最適化を図ることで、解析効率や精度を高めることを狙っていく。
二つ目は、現在育成している検体として利用可能な高週齢マウスを用いた解析である。この高週齢マウスは、現在（２０２４年５月時点）で１４０週齢であり、行動観察や個体観察の結果、４匹以上に運動障害（下肢筋肉の衰え、前足の震えの増加）を持ち、２匹については白内障が観察されている。これらの高週齢マウスの脳内ライセートや眼球を検体として本手法を適用させることで、既知および未知のタンパク質の検出を目指す。特に、本研究の初期目標として設定していなかったが、自然的加齢現象としてマウスに発生した白内障眼球においては、白内障モデルマウスを用いた実験においてクリスタリンの異性化が知られている一方で、詳細な異性化プロファイリングを目的としたプロテオーム解析はされていない。この検体を用いて他の異性化タンパク質を検出することで更なる生物学的および病態学的な知見が得られると考えられる。
その他にも、加齢的な要因とみられる消化器官の機能低下などもみられており、これら各体内器官に絞った詳細なプロテオーム解析を行っていくことで未知の異性化タンパク質を検出していく。
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