| Project/Area Number |
23K04800
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 34020:Analytical chemistry-related
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| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
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Principal Investigator |
絹見 朋也 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 計量標準総合センター, 主任研究員 (90293125)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
末松 和美 (七種和美) 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 計量標準総合センター, 主任研究員 (60608769)
浅川 大樹 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 計量標準総合センター, 上級主任研究員 (60584365)
川崎 ナナ 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 教授 (20186167)
加藤 昌弘 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 計量標準総合センター, 研究グループ長 (70392602)
山口 英俊 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 計量標準総合センター, 研究員 (10783194)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
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| Keywords | モノクローナル抗体 / 質量分析 / 構造解析 / ペプチドマッピング / 放射線 / 翻訳後修飾 |
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| Outline of Research at the Start |
放射性核種で標識した抗体医薬品やペプチド医薬品の開発が進む一方、放射線によるタンパク質の構造への影響については不明な点が多い。本研究課題では、放射線によるタンパク質の構造変化を明らかにするため、質量分析を活用した構造解析を実施する。様々な線量のガンマ線を照射したモノクローナル抗体やその部分ペプチドについて、ペプチドマッピングやネイティブ質量分析をはじめとした質量分析を活用した構造解析を行う。ミクロからマクロな抗体の構造変化を明らかにすることで、タンパク質の放射線障害の分子機構解明につなげる。
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度においては、モノクローナル抗体（IgG1, AIST-MAB）のネイティブ質量分析および示差走査蛍光定量法（DFS）による高次構造解析を実施し構造変化を精査した。あわせて糖鎖マッピングを行い構造変化を解析するための基盤構築を進めた。
DFSによりAIST-MABのCH2領域およびFab領域における変性温度を測定した。500 Gyのガンマ線を照射した抗体はコントロールと比べどちらの領域においても数度変性温度が低く、変性曲線が幅広くなることから構造の不安定性が示唆された。一方でフェントン試薬処理を行った抗体と比べ変性温度の変化は小さく、500 Gyのガンマ線照射では高次構造変化は小さいと考えられた。
一方、ガンマ線照射およびコントロール試料のネイティブ質量分析では、フルボディ抗体とともに、Fc領域が解離したF(ab)2が観測された。コントロールと比較すると、ガンマ線照射試料ではフルボディ抗体の多価イオンピークが高価数側に移動し、F(ab)2のピーク強度が強く観測された。フェントン試薬処理抗体においても同様の現象が見られたが、ガンマ線照射に比べてその影響は大きかった。以上よりガンマ線照射により抗体分子全体の構造不安定化とともにCH2領域の不安定化によりF(ab)2の解離が進むことが示唆された。
AIST-MABのN-結合型糖鎖について詳細な糖鎖マッピングを行った。抗体から切り出された糖鎖を2-アミノベンズアミドおよびRapi-Fluorキットによる誘導体化、LC-蛍光検出, 質量分析による分析を行った。米国NISTが頒布する抗体標準物質の分析結果をあわせて構造を解析した。この結果、37種の糖鎖構造を同定した。いずれもCHO細胞で産生されるIgGの典型的な構造であり、放射線照射への影響を精査するうえでの基盤を構築した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
前年度のタンパク質部分の一次構造解析に加えて、ネイティブ質量分析による高次構造解析と示差走査蛍光定量法によって抗体分子のマクロな構造変化を解析することが可能となった。また、詳細な糖鎖マッピングについても行い、解析基盤は整ったといえる。一方、側鎖の構造変化や抗原ペプチドとの結合特性について、放射線照射した実試料やフェントン反応による酸化ストレスモデルへの適用が進まなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
放射線照射試料について、アミノ酸側鎖の構造解析、および糖鎖マッピングによる構造解析を進める。一方、抗原ペプチドとの結合特性についてネイティブ質量分析による解析を行い、抗体分子の放射線照射による一次構造から高次構造への構造安定性の解明を目指す。
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