| Project/Area Number |
23K04939
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 37020:Chemistry and chemical methodology of biomolecules-related
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| Research Institution | University of Toyama |
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Principal Investigator |
井川 善也 富山大学, 学術研究部理学系, 教授 (70281087)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松村 茂祥 富山大学, 学術研究部理学系, 講師 (40619855)
吉野 惇郎 富山大学, 学術研究部理学系, 助教 (70553353)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
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| Keywords | 蛍光RNAアプタマー / 進化分子工学 / RNA集積ナノ構造 |
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| Outline of Research at the Start |
RNAを可視化する機能モジュールとして、色素との結合に応じてその発光を誘起するRNAアプタマー（蛍光RNAアプタマー）が注目されつつある。しかし、蛍光RNAアプタマーの創出や高機能化の方法論は発展途上であり、リガンドとの結合能を選別指標とする従来法とは異なる「次世代創出法」が切望される。本計画では微量液滴にRNA配列を封入し、蛍光発光を指標としてライブラリを選別する新手法（in droplet 進化工学）をコア技術として、１）蛍光RNAアプタマーの直裁的創出法の確立、２）蛍光RNAアプタマーや色素リガンドを集積化し、「1 RNA・1 色素」複合体を超える機能の開拓、を行う。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本計画では微量液滴にRNA配列を封入し、蛍光発光を指標としてライブラリを選別する新手法（液滴進化工学）を中核技術とし、蛍光RNAアプタマーの直裁的創出法の確立、蛍光RNAアプタマーや色素リガンドを集積化し、「1 RNA・1 色素」複合体を超える機能の開拓を行う。
蛍光RNAアプタマーの液滴進化工学については、液滴封入ライブラリの作成法として３つの方法を並行的に検討した。NASBA法とRCA法については、機能性RNAライブラリを封入し、ライブラリを蛍光選別できることを確認した。BEAM法についてもモデルRNAによる選別実験に成功した。さらに手法の確立が最も先行したRCA法を用いて機能未知の蛍光アプタマーの実験進化を行い、２段階の進化実験を経て、出発配列よりも蛍光発光能が３倍向上したRNA集団の取得に成功した。新規な蛍光RNAアプタマーのクロモフォアとなる色素分子については、母格となるHBI系色素の合成を分担者（吉野）が行い、２年次以降の色素の多価化に必要な基盤が整備できた。
蛍光RNAアプタマーの集積化については、RNAプラットフォーム構造のデザインについては、従来から定評・実績の高い構造予測やモデリングプログラムに加え、近年の当該分野の進展の成果を反映したAIベースの二次構造予測プログラムや新しい構造予測・デザインプログラムを積極的に導入し、デザイン精度の向上や多重的な検証に努めた。３つの蛍光アプタマーユニットを環状３量化あるいは環状４量化させるRNAプラットフォーム構造のデザインを行った。完了し、蛍光アプタマーユニットの組み込みを行い、単体状態での蛍光特性を損なうことなく、ナノ集積構造を構築できることを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
蛍光RNAアプタマーの進化工学に必要なライブラリ作成技術は、当初予定通りNASBA法とRCA法によるライブラリ作成技術を確立した。BEAM法についてもモデルRNAによる選別実験に成功した。蛍光RNAアプタマーの集積化については、構造デザインが当初の予定通り完了した。以上の状況から、当初予定通りに実験が進捗していると判断できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
蛍光RNAアプタマーの液滴進化工学、蛍光RNAアプタマーの集積化と実験進化のいずれも、順調に進行しているため、２年次も当初計画に従って研究を遂行する。液滴進化工学ではBEAM法によるRNAライブラリの作成を完了した上で、３つの方法の長所短所と標的とする蛍光RNAアプタマーの機能構造を対応させ、各表的に適した手法で実験進化を行う。RNA集積体の実験進化に必要なゲノム型遺伝子のデザインと液滴封入を行う。蛍光RNAアプタマーの集積化については、デザインされた集積構造で、集積状態特有の機能発現（２つの蛍光RNAアプタマー間でのFRETなど）を行う。
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