| Project/Area Number |
23K04986
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 38020:Applied microbiology-related
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
吉田 彩子 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 助教 (90633686)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | アセチルCoA合成酵素 / 転写制御 / Thermus thermophilus / 酢酸応答 / 代謝調節 |
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| Outline of Research at the Start |
アセチルCoAなどの短鎖アシルCoAは、生体内で起こる様々な化学反応に、基質や中間体として関与している。そのため様々な短鎖アシルCoAの合成に関わる酵素の機能や調節機構を理解することは、細胞内代謝の全体像の理解を目指す上で重要である。
高度好熱菌における複数のアシルCoA合成酵素ホモログには、本酵素ホモログには例を見ない転写因子との融合タンパク質が存在し、この融合タンパク質が酵素活性を持たないにもかかわらず酢酸資化に必須である。本研究では、好熱菌のアシルCoA合成酵素ホモログの機能解明や機能発現調節機構を通じて、炭素源への応答や脂肪酸代謝などの細胞内の代謝反応を理解することを目的とする。
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究対象としている高度好熱菌には4つのアセチルCoA合成酵素（ACS）ホモログ遺伝子が存在し、そのうちの一つは転写因子ドメインとの融合タンパク質（ACS2）である。これまでの解析からacs2遺伝子が酢酸資化に必須であることや、ACS2が直接的または間接的にアセチルCoA合成酵素遺伝子（acs1）発現を酢酸に応答して調節することが示唆されている。
acs1とacs2の遺伝子間領域へのACS2の転写因子ドメインの結合について、ゲルシフトアッセイにより調べたところ、DNAとタンパク質複合体の形成によるバンドシフトが観察された。ACS2が酢酸に応答してacs1遺伝子発現を調節している可能性があることから、酢酸の有無により転写因子ドメインとDNAとの親和性が変化するかも調査したが、顕著な違いは見られなかった。これはACS2の酵素としての機能は示さないACSドメインがリガンド結合ドメインとして機能してDNAへの結合能を調節していることを暗に示唆している。また、ACS2の転写因子ドメインおよびACSドメインの各ドメインをコードする遺伝子を欠失した部分破壊株を作製し、酢酸を単一炭素源とする培地にて生育を調べたところ、転写因子ドメインの欠損株だけでなくACSドメインの破壊株も生育を示さなかった。このことから、これら両ドメインがACS2の機能に必要であることが示唆され、この結果もACS2のACSドメインがリガンド結合ドメインとして機能することを支持するものであった。以上より、ACS2の転写因子としての機能へのACSドメインの関与が示唆され、今後はエフェクターの同定やエフェクターの有無による転写発現調節機構にフォーカスして研究を進めていく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ACS2の転写因子ドメインとacs1-acs2遺伝子間領域を含むDNAとの直接的な結合をゲルシフトアッセイにて検出することができ、ACS2がacs1遺伝子発現調節に直接的に関与する可能性を見出せた。また、ACS2の転写因子ドメインだけでなく、酵素としての機能は示さないACSドメインが、その酢酸資化能に必須であることを遺伝子破壊実験から示すことができ、ACSドメインがACS2の機能を調節するリガンド結合ドメインとして働くことが支持された。
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| Strategy for Future Research Activity |
ACS2のACSドメインがリガンド結合ドメインとして機能し、何らかのエフェクター分子の結合に応答してACS2とDNAとの結合親和性を変化させることが示唆された。これまではACS2の転写因子ドメインを用いてゲルシフトアッセイを行ってきたが、全長のACS2を用いたゲルシフトアッセイを推定エフェクター分子の存在下、非存在下で行うことで、ACS2のDNA結合について解析を行うことでエフェクター分子の同定を行う。さらに、in vitro転写アッセイを組み合わせることでACS2によるacs1遺伝子発現調節機構を明らかにする。
また、ACS2の転写因子ドメインと同じファミリーに属し、単独でゲノム上にコードされている転写因子IclRについても、これまでにその破壊株および過剰発現株の作製が完了しているため、生育やacsホモログ遺伝子の発現調節への関わりを調べることで、本菌における酢酸応答機構解明の足掛かりとする。
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