常在細菌からの創薬～宿主誘導性の抗菌作用の解析と応用

• Project/Area Number: 23K04997
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 38020:Applied microbiology-related
• Research Institution: Jikei University School of Medicine
• Principal Investigator: 田嶌 亜紀子 東京慈恵会医科大学, 医学部, 講師 (70317973)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2025: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2023: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
• Keywords: 常在細菌 / コリネバクテリウム / 抗菌作用 / BGC / 脂肪酸

Outline of Research at the Start

感染症は、抗菌薬によって治る病気だったが、薬剤耐性菌の増加によって、治療が難しくなってきている。今後、薬剤耐性菌に起因する死亡者数は増加の一途をたどることが予想され、新たな薬の開発が急務である。抗菌薬の開発では、土壌中の微生物から抗菌物質を見つけ出し、薬に応用されてきたが、新たな物質が発見できなくなったため、土壌以外の様々な生物資源を利用する動きが出てきた。そこで、人の常在菌を用いて、抗菌作用の有無について調べたところ、病原細菌に対して抗菌作用を示す細菌を見出した。本研究は、人の常在菌がもつ抗菌作用を解明して、抗菌薬への応用を目指していくものである。

Outline of Annual Research Achievements

新規抗菌薬開発のための新たなアプローチとして、微生物ゲノム情報を基に新しい天然化合物（微生物代謝産物）を探索し、有用な新規抗菌物質を見出す取り組みが行われている。ヒトの常在細菌は、重要な創薬資源の一つとなると考えられ、我々はこれまでに常在細菌（コリネバクテリウム）が、脂肪酸存在下で病原細菌（黄色ブドウ球菌）に対して抗菌作用を示すようになる新規の現象を見出している。このメカニズムを解明するため、代謝産物の生合成遺伝子(BGCs)に着目して、抗菌作用の原因遺伝子の同定を試みた。
ゲノム配列から予測された生合成遺伝子クラスターについて、菌株・菌種間での保存状況、遺伝子発現の有無を確認し、候補となる遺伝子クラスターを絞り込んだ。遺伝子クラスターの欠失変異株を作製したところ、抗菌活性の消失が認められ、アミノ酸配列から予測される遺伝子クラスター内の各遺伝子の機能や局在は、シグナル配列を持つ前駆体ペプチド、膜貫通ドメインを有するトランスポータータンパク、修飾酵素であることが示唆された。RT-PCR解析から遺伝子クラスターはオペロン構造を含んでおり、各遺伝子の欠失株変異株の解析から、抗菌活性に必須のオペロンを同定した。またオペロン内の１遺伝子を欠失すると、野生株の抗菌作用に感受性を示すようになったことから、自身の抗菌物質から身を守る自己耐性遺伝子であることが判明した。以上より、抗菌作用は、オペロン構造を持つ生合成遺伝子群が担っていることが明らかになった。これらの結果を基に、今後、抗菌因子の精製・同定を行うことができ、新たな抗菌因子が判明することが期待される。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

抗菌因子の同定・解析を行うため、今年度は、①抗菌失活変異株の作製と遺伝子の同定・解析、②遺伝子発現解析に取り組んだ。①については、生合成遺伝子（BGCｓ）データから予測した遺伝子クラスターの欠失変異株を作製し、抗菌活性の消失が見られ、遺伝子欠失変異株の解析から、抗菌因子の生合成遺伝子を同定することができた。②については、遺伝子クラスターのオペロン構造を明らかにし、菌株・菌種間における遺伝子保有分布を検討した。TetRファミリー等の調節遺伝子は遺伝子クラスター近傍には検出できず、プロモーター解析を含めて脂肪酸による誘導をもたらす仕組みは今後の解析が必要である。現在、抗菌因子の同定を行うため、同定した遺伝子クラスターを基にした過剰発現系の構築が進行中である。以上より、本研究は、ほぼ当初の予定通り進んでいると考えられる。

Strategy for Future Research Activity

抗菌因子を同定するため、現在、構築中の過剰発現系を用いて、菌の培養上清を分画し、因子の同定を行うとともに、精製系を確立する。次に、抗菌作用の機序を解析するために、抗菌因子のMIC、抗菌スペクトルや適正濃度を調べるとともに、抗菌因子による菌の形態学的変化や核酸・アミノ酸などの合成への影響、因子の菌体内局在などを解析することにより作用機序を明らかにしていく。更に、本因子が細菌の病原性に作用するのかどうかについて、黄色ブドウ球菌の病原因子発現への影響やバイオフィルム形成への有効性を検討する。