| Project/Area Number |
23K05020
|
|---|
| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
|
| Allocation Type | Multi-year Fund |
|---|
| Section | 一般 |
|---|
| Review Section |
Basic Section 38020:Applied microbiology-related
|
|---|
| Research Institution | Sojo University |
|---|
Principal Investigator |
浴野 圭輔 崇城大学, 生物生命学部, 教授 (30310030)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
齋藤 浩之 福岡県工業技術センター, その他部局等, 専門研究員 (60416493)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
|
| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
|
| Budget Amount *help |
¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
|
|---|
| Keywords | Bacillus thuringiensis / 細胞損傷タンパク質 / Parasporin |
|---|
| Outline of Research at the Start |
本研究は、BTが産生する選択的細胞損傷タンパク質を網羅的に探索し、その詳細を明らかにすることで、新奇なパラスポリンを発見する。探索を実施するためのリソースは我々が有する5000株におよぶBT菌株ライブラリーであり、そこから細胞損傷活性を指標に目的タンパク質をスクリーニングする。次に一次構造を明らかにするとともに、様々な培養細胞に対する損傷活性を定量的に解析して細胞損傷スペクトルを解析することで、その詳細を明らかにする。これまでに報告されているパラスポリンは6種類あり、その後長く新奇パラスポリンは報告されていない。新奇パラスポリンを発見することで、新しい知見を得る。
|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、Bacillus thuringiensis（Bt）が産生する選択的細胞損傷タンパク質Parasporin（PS）の新規ファミリー候補の探索と機能解析を目的とし、保有する約5000株のBt菌株ライブラリーを対象にスクリーニングを実施した。令和6年度は、前年度までに細胞損傷活性を示した候補株A3056について、培養・結晶性タンパク質の回収後、アルカリ可溶化およびproteinase Kによる活性化処理を施し、陰イオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーを用いて部分精製を行った。得られた主要バンドをSDS-PAGEにより確認し、nanoLC-MS/MS解析により、既知のPS3と48.9%の相同性を持つ新規タンパク質（A3056PS）を同定した。同定したA3056PS遺伝子は、オペロン構造を有しており、上流に機能未知のタンパク質を、下流に典型的な130kDa型の殺虫タンパク質における保存された領域（ブロック6から8）を含むC末端領域のみを含むタンパク質をコードしていた。この構造はPS3のそれとほぼ同じであり、活性本体であるorf2が48.9%一致したのに対し、orf1は86%、orf3は79%一致し、比較的高い相同性を示した。さらに、大腸菌pET発現系を用いた組換えタンパク質を調製したが、その際、orf2のみでは目的タンパク質の発現が確認できなかったのに対し、3つすべてのorfを発現することで初めて目的タンパク質を得ることができた。
活性化したA3056PSについて、HepG2およびSawano細胞に対する損傷活性を評価した。その結果、A3056PSはHepG2に対して高い活性（EC50=0.032 mcg/ml）を示し、PS3が影響しないSawano細胞に対しても活性を持つことが判明した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和6年度は、昨年度に選抜したBt A3056株の結晶性タンパク質について、部分精製と同定を行った。SDS-PAGEで検出された主要バンドをnanoLC-MS/MSで解析した結果、PS3と48.9%の相同性を持つ新規タンパク質（A3056PS）を同定した。A3056PS遺伝子はオペロン構造を形成しいており、上流と下流にそれぞれ1つずつのorfが存在してた。大腸菌による組換えタンパク質の生成においては、3つのorfすべてを発現してはじめて目的タンパク質を取得することができた。本タンパク質は不溶性として発現し、可溶化・活性化処理後に細胞損傷活性を評価したところ、HepG2細胞に対してはPS3より約100倍高い活性（EC50: 0.032 mcg/ml）を示し、さらにPS3が活性を示さないSawano細胞にも活性を示した（EC50: 0.89 mcg/ml）。この結果、A3056PSは既知のPSとは異なる細胞選択性を有し、新たなPSファミリーの候補であることが示唆された。現在は、遺伝子配列と構造予測をもとに、機能解析のさらなる展開を進めており、次年度以降に予定する構造解析や機能ドメインの特定に向けた準備が整いつつある。
|
| Strategy for Future Research Activity |
今後は、A3056PSの構造機能相関の解明を主な目的として、アミノ酸変異体の作製および機能解析を進める予定である。令和6年度までに、A3056PSは既知のParasporin 3（PS3）とは異なる細胞選択性を示すことが確認されており、Sawano細胞に対しても活性を持つことから、新たな作用機序を有する可能性がある。これを踏まえ、今後は部位特異的変異導入を行い、細胞損傷活性に寄与するアミノ酸残基の同定を目指す。また、活性化処理前後での構造変化の予測およびドメインごとの発現を通じて、活性発現に必要な構造領域の特定も行う予定である。さらに、損傷機構の解明に向けて、標的細胞への結合様式や細胞内イベント（例：細胞膜障害、アポトーシス誘導など）を解析する実験系の構築を進める。これにより、A3056PSの機能を分子レベルで理解するとともに、Parasporinファミリーの中での位置づけや特異性を明らかにすることが期待される。
|
