酵母のスレオニン脱アミノ化酵素に見出した新規活性制御機構の解明

• Project/Area Number: 23K05040
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 38030:Applied biochemistry-related
• Research Institution: Nara Institute of Science and Technology
• Principal Investigator: 磯貝 章太 奈良先端科学技術大学院大学, 研究推進機構, 特任助教 (60735645)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000); Fiscal Year 2025: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2024: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000); Fiscal Year 2023: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
• Keywords: スレオニン脱アミノ化酵素 / 活性制御機構 / イソロイシン生合成 / 出芽酵母 / アロステリック制御

Outline of Research at the Start

イソロイシン（Ile）は、多様な生理機能を有する必須アミノ酸であり、食品・化粧品中の香気成分や次世代バイオ燃料の前駆体となる。そのため、Ileを高生産する酵母は、食品中の香気成分の多様化やバイオ燃料生産に資することが期待できる。酵母のIle生合成は、スレオニン脱アミノ化酵素TDの活性制御によって調節されるため、TDの活性制御機構を理解し高機能化することで、Ile高生産酵母の創出につながることが期待できる。本研究では、酵母のTDに見出した新規活性制御機構の解明を目的としている。

Outline of Annual Research Achievements

イソロイシン（Ile）は多様な生理機能を示すアミノ酸であり、食品・化粧品中の香気成分や次世代バイオ燃料の前駆体となる。酵母のIle生合成では、Ileのフィードバック阻害によるスレオニン脱アミノ化酵素（TD）Ilv1の活性制御によって生合成量が調節されるため、Ilv1の活性制御機構を解明することでIle生産性の向上が期待できる。様々な生物由来TDの解析から、阻害剤であるIleの結合によりTDの多量体構造が変化することが知られている。申請者は、Ilv1の２つの制御ドメインをつなぐリンカー領域中のヒスチジン残基（His480）のチロシン置換(His480Tyr)により多量体構造が安定化し、Ileによる活性制御が解除される可能性を見出した。そこで本研究では、His480を中心に、リンカー領域中の残基に対するアミノ酸置換の導入がIleによる活性制御や構造変化に与える影響を解析し、リンカー領域を介したTDの新たな活性制御機構の詳細を解明することを目的とした。2023年度は以下について実施した。
１．His480に対する各種アミノ酸置換の導入がTD活性に与える影響の解析
Ilv1の立体構造モデルにおいてHis480をチロシン以外のアミノ酸に置換した結果、His480Tyrと同様に多量体構造に影響を与える可能性のある２つのアミノ酸置換を同定した。そこで同定したアミノ酸置換を導入したIlv1変異体を実験室酵母で発現させたところ、期待通りにIleの生産性が向上した。
２．Ilv1の活性制御と多量体構造変化の関係性の解析
野生型および複数の変異型Ilv1を対象とした解析を予定しているため、まずは様々な条件における多量体構造の変化を簡便に解析することが可能なBlue-Native PAGE（BN-PAGE）を用いた解析系を検討した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

研究実績の概要に記載した通り、Ile生産性向上に寄与するIlv1変異体を新たに2つ取得することができた。また、組換え酵素を用いたIlv1の活性制御と多量体構造変化の関係性の解析についても、BN-PAGEによる解析系の最適化を進めており、上記の進捗状況区分とした。

Strategy for Future Research Activity

取得したHis480のアミノ酸置換体について、Ileによるフィードバック阻害への感受性や速度論的パラメータを解析する。
また、BN-PAGEやゲルろ過クロマトグラフィーを用いた多量体構造の解析系を構築し、野生型およびHis480変異体Ilv1を対象に、活性制御と多量体構造変化の関係性について解析する。