| Project/Area Number |
23K05114
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 38050:Food sciences-related
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| Research Institution | Miyagi University |
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Principal Investigator |
金内 誠 宮城大学, 食産業学群, 教授 (70404845)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2028-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,550,000 (Direct Cost: ¥3,500,000、Indirect Cost: ¥1,050,000)
Fiscal Year 2027: ¥130,000 (Direct Cost: ¥100,000、Indirect Cost: ¥30,000)
Fiscal Year 2026: ¥130,000 (Direct Cost: ¥100,000、Indirect Cost: ¥30,000)
Fiscal Year 2025: ¥130,000 (Direct Cost: ¥100,000、Indirect Cost: ¥30,000)
Fiscal Year 2024: ¥520,000 (Direct Cost: ¥400,000、Indirect Cost: ¥120,000)
Fiscal Year 2023: ¥3,640,000 (Direct Cost: ¥2,800,000、Indirect Cost: ¥840,000)
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| Keywords | 乳酸菌 / 表層タンパク質 / ヒートショックタンパク |
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| Outline of Research at the Start |
発酵食品での応用のために、他微生物を感受すると考えられる表層タンパク質（HSP70；Heat Shock Protein70とそのシャペロンタンパク質；DnaK）を解析し、「センサー」様機能について解明する。これまで、乳酸菌の表層タンパク質（HSP70やDnaK）は大腸菌の細胞膜組成のLPS（リポポリサッカライド）と結合すると報告したが、それによる乳酸菌の代謝への影響は明らかでない。そこで、本研究では、乳酸菌の一部の表層タンパク質がLPSを感知すると「センサー」様機能を果たし、LPSを分解へ導くと仮定し、表層タンパク質（主にHSP70やDnaK）の役割について検討する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
Pediococcus pentosaceus AK23 株の、グラム陰性細菌由来のLPSの消去メカニズムに着目し、LPSの表層タンパク質のDnaK/DnaJ chaperonesに与える影響について明らかにすることを目的とした。 AK23株は，38.7％と高いLPS消去能を示した。そこで， Brevibacillus choshinensis株を用いて，DnaKタンパク質高発現株を作出を試みた。その結果，Asamiの報告した通りにLPS消去活性が高い株をもつ，DnaKタンパク質高活性株を得ることができなかった。
本来のDnaKタンパク質高発現株のインサートDNAは，DnaK/DnaJ chaperones のATP-binding subunitが含まれており、ATPase活性を持つ可能性が考えられる。そこで，組み換えタンパク質（リコンビナントDnaKタンパク質）のATPase活性についても検討したが，ATPase活性は持たなかった。さらに確認のため，リコンビナントDnaKタンパク質の精製を行った。組み換え株の生産したDnaKタンパク質にはHisタグをもつ。そこで，Niカラムを用いて，rDnaKを精製し、電気泳動によるタンパク質を検出した。さらにATP-binding subunitを持つために何らかのATPase活性を持つ可能性が考えられるため、ATPase活性の有無を検討した。
その結果からもタンパク質の生産は少なく検出はできず，ATPaseも検出できなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度の研究の方策として，昨年度に引き続きPediococcus pentosaceus AK23 株のグラム陰性細菌由来のLPSの消去メカニズムに着目しLPSの表層タンパク質のDnaK/DnaJ chaperonesに与える影響についてをあきらかにする。そのために昨年度は成功しなかったヒートショックタンパクのシャペロンでもあるDnaK/DnaJ の高生産株の作出を行いどのように結合するか，あるいはATPaseの活性についても明らかにする。AK23株に対するストレス活性を調査するために用いるためDnaK/DnaJ chaperonesノックアウト株の作成を行う。さらにLPSを持つ大腸菌がPediococcus pentosaceus AK23 株へどのように影響するかについても検討するため，共培養を行い，その形状の変化や増殖速度，菌体メタボリズム解析などを行う予定である。
このような抗ストレス活性を調査することで、LPS消去メカニズムにおける、HSP70やDnaKの機能について明らかにすることが可能であると考えられる。また、ＡＫ23株の機能解明により、食品加工だけでなく医薬品や家畜飼料素材の応用等、更なる有効性の拡大が期待できると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度の研究の方策として，昨年度に引き続きPediococcus pentosaceus AK23 株のグラム陰性細菌由来のLPSの消去メカニズムに着目し、LPSがLPS消去に関与する表層タンパク質のDnaK/DnaJ chaperonesに与える影響をあきらかにする。そのために昨年度は成功しなかったヒートショックタンパクのシャペロンでもあるDnaK/DnaJ の高生産株の作出を行いどのように結合するか，あるいはATPaseの活性についても明らかにする。AK23株に対するストレス活性を調査するために用いるためDnaK/DnaJ chaperonesノックアウト株の作成を行う。さらにLPSを持つ大腸菌がPediococcus pentosaceus AK23 株へどのように影響するかについても検討するため，共培養を行い，その形状の変化や陪乗速度，菌体メタボリズム解析などを行う予定である。
このような抗ストレス活性を調査することで、LPS消去メカニズムにおける、HSP70やDnaKの機能について明らかにすることが可能であると考えられる。また、ＡＫ23株の機能解明により、食品加工だけでなく医薬品や家畜飼料素材の応用等、更なる有効性の拡大が期待できると考えられる。
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