| Project/Area Number |
23K05337
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 40020:Wood science-related
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| Research Institution | The University of Tokushima |
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Principal Investigator |
服部 武文 徳島大学, 大学院社会産業理工学研究部(生物資源産業学域), 教授 (60212148)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
山村 正臣 徳島大学, 大学院社会産業理工学研究部(生物資源産業学域), 准教授 (00948367)
川上 竜巳 徳島大学, 大学院社会産業理工学研究部(生物資源産業学域), 准教授 (90380120)
林 順司 徳島大学, 大学院社会産業理工学研究部(生物資源産業学域), 講師 (20802101)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2025: ¥780,000 (Direct Cost: ¥600,000、Indirect Cost: ¥180,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,730,000 (Direct Cost: ¥2,100,000、Indirect Cost: ¥630,000)
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| Keywords | カルボキシル メチルトランスフェラーゼ / マツタケ / ケイ皮酸メチル / Tricholoma matsutake / カルボキシルメチルトランスフェラーゼ |
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| Outline of Research at the Start |
マツタケの主要な香り物質の一つであるケイ皮酸メチルは、L-フェニルアラニン→ケイ皮酸→ケイ皮酸メチルの代謝経路で生合成される。本研究は、マツタケに由来するケイ皮酸をメチル化するカルボキシルメチルトランスフェラーゼの活性中心で機能する、アミノ酸残基機能を明らかにすることを目的とする。まず、本酵素の結晶化に挑戦し、得られた結晶をX線結晶解析する。結晶が得られない場合は、構造モデルをシミュレーションし、当該アミノ酸残基を推定し、当該残基を別のアミノ酸に置き換えた組換えタンパク質を調製し、これらアミノ酸の機能を明らかにする。以て、マツタケの特徴的な香りの生合成機構に関する知見を得る。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、マツタケにおいて、ケイ皮酸をメチル化する活性を有するS-adenosyl-L-methionine-dependent cinnamic acid carboxyl methyltransferase活性を有するタンパク質TmCAMT1に関し、1) 特性解明、2) 結晶化、または、AlphaFold IIを用いたstructure model の作成とその解析により、活性中心に配置しているアミノ酸残基の酵素反応における役割を解明することである。2024年度は、TmCAMT1の特性解明(酵素反応至適温度、同至適pH、金属イオンの要求性、ミカエリス定数、catalytic constant、アミノ酸一次配列を基にしたアライメント、AlphaFold IIによる三次元構造および活性中心予測モデルと同活性を有する植物のバジル(Ocimum basilicum ) (Kapteyn et al., 2007)、コケ類 (Conocephalum salebrosum) (Zhang et al., 2019)との比較により明らかにした類似点と相違点を、明らかにした。さらに、TmCAMT1に相同性が高いタンパク質は、担子菌類に特異的に見いだされることも分かった。これらの内容を、2nd International Lignin Symposium (69th Lignin Symposium)にて研究発表し、論文として発表した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2024年度に検討予定であった当初計画と結果は以下の通りである。まず、シャペロンタンパク質を用いたTmCAMT1組換えタンパク質の大量培養方法の確立については、pG-KJE8, pGro7, pKJE7, pTf16の各プラスミドがコードするシャペロンタンパク質をTmCAMT1と大腸菌で共発現させた。培養条件として、L-アラビノース、テトラサイクリンの添加量および添加するタイミングを変えて検討し、電気泳動にてTmCAMT1の生成量、可溶性画分あるいは不溶性画分の存在量を比較した。しかしながら、TmCAMT1の生成量の増大は認められず、結晶化に必要なTmCAMT1を調製する事は出来なかった。その結果、本助成期間に結晶化に取り組むことは中断した。次に、TmCAMT1の活性中心と予測される部位のアミノ酸の役割解明については、AlphaFold IIを用いた検討により予測された、TmCAMT1の活性中心のアミノ酸残基の内1残基を部位特異的に変異させたタンパク質を調製し、活性の消失を確認し、当該アミノ酸が必須の役割を果たしていると考察した。続いて、他の微生物で報告された類似の活性を有する酵素と最も相同性が高いホモログタンパク質を、申請者らがHattori et al. Journal of Wood Science (2025) 71:11、で報告した方法により、クローニング及び調製したが、活性は確認されなかった。以上、結果的に活性中心部位のアミノ酸の役割をさらに進めていくことに計画の変更をするに至ったが、当初の予定していた計画については概ね検証することができたので概ね順調に進んでいると評価した。
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| Strategy for Future Research Activity |
まず、2024年度のAlphaFold IIを用いた検討により、TmCAMT1の活性中心と予測される部位のアミノ酸残基の内1つの役割を考察する結果を得たが、残りのアミノ酸残基の内、既往の文献により酵素反応の基質特異性を制御するアミノ酸に該当する残基に関し、部位特異的変異を施した組換えタンパク質を調製する。これらのタンパク質を2023、2024年度確立した調製方法にて調製し、基質特異性の変化を、変異を施していないタンパク質と比較し、アミノ酸残基の役割を考察する。次に、マツタケのRNA-seqで発現が確認されたS-adenosyl-L-methionine-dependent methyltransferaseの中から、TmCAMT1以外で、活性に必須のアミノ酸が保存されている配列をコードするcDNAをクローニングし組換えタンパク質を調製する。調製されたタンパク質がcinnamic acid carboxyl methyltransferase活性を有するか否か明らかにする。活性が見出された配列については、速度論的解析による酵素特性を解明する。加えて、マツタケ培養菌糸にL-phenylalanineを添加することによる生成が誘導されるケイ皮酸メチル定量値と、新たに明らかにするcDNAと、TmCAMT1のいずれの遺伝子発現が一致するのか、定量的PCRで明らかにする。これらの結果を以て、マツタケケイ皮酸メチル生合成を行う遺伝子の特定、酵素タンパク質の特性、活性に必要なアミノ酸残基に関し総括する。
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