| Project/Area Number |
23K05504
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 42010:Animal production science-related
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| Research Institution | Yamagata University |
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Principal Investigator |
木村 直子 山形大学, 農学部, 教授 (70361277)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
Fiscal Year 2023: ¥2,340,000 (Direct Cost: ¥1,800,000、Indirect Cost: ¥540,000)
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| Keywords | 原始卵胞 / 維持 / 卵巣 / マウス / 新生仔 / 卵母細胞 / 生殖寿命 |
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| Outline of Research at the Start |
申請者らは、生涯の卵巣機能のボトルネックとなり得る新生仔期の原始卵胞数が1.2～2.8倍に増加する4種のマウスモデルを見出した。これらのモデルでは、性成熟後も備蓄原始卵胞プールが一定の割合で維持されて生涯累計産仔数が1.2～1.4倍に向上するものと、維持されず生殖能が変わらないものがあり、その理由は不明であった。本課題では、備蓄原始卵胞プールの維持に寄与する主要な分子機構の解明とその制御を目的に、トランスクリプトーム情報からの候補分子と、未開拓なクロマチンのエピジェネティクス制御分子に着目し、4種のモデルで発現解析を行う。さらに卵巣培養系や生体での制御実験を行うことで、表現型を検証する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
1. 計画１のD11投与モデルでのRNA seq解析から得られた差次的遺伝子の発現動態について、現在までに顕著な発現があったものがないため、低酸素環境下で活性化するとされる硫黄代謝に関する酵素類（シスタチオニン β-シンターゼ（CBS）、シスタチオニン γ- リアーゼ（CSE）、SQOR、CARS）の発現動態の解析に着手している。現在までに、受精卵や子宮で検出使用可能な抗体を入手できたので、新生仔マウスの卵巣などで検証を行う。
2. 計画２の新生仔卵巣の器官培養系による主要な分子と経路の制御試験は、老齢期でも備蓄原始卵胞数が高く維持されるxCT欠損雌マウスの卵巣の器官培養あるいは卵胞培養により解析を試みる。ただし当研究室が所持しているxCTKOマウスはC57BL6j系で、野生型でも受精卵の培養成績が低いため、遺伝子欠損の影響がマスクされ、みえにくいのが課題である。そこで野生型では卵の培養成績が比較的安定しているICRマウスで8代以上のバッククロスを行い、ICR系xCTKOの造成を行った。現在ICR系xCTKOマウス卵の表現型がC57BL6j系と同様であるかを確認中であり、体外成熟-受精させた受精卵の発生能は同様な傾向であった。今後、このモデルで検討を進める。
3. 本課題に付随して、無数の卵胞が存在する卵巣組織切片の評価が必要であり、実験者の熟練と多大な時間を要する。熟練者でなくても遂行可能で負担が少ない方法として、YOLOv9を用いた卵巣組織切片の卵胞を発育ステージ毎に自動計測が可能なAI（人工知能）モデルの構築を試みた。その結果、写真画像から、二次卵胞以降ではF値0.86以上の精度で検出できたが、原始卵胞は精度が低く、撮影倍率を上げる(10倍→20倍)ことで、精度は0.64まで上がった。まだ検討の余地はあるが、AI技術を本課題の解析手法に導入できることが明らかとなった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
1. RNA seq解析から得られた差次的遺伝子の発現動態について、現在までにD11モデルで検証し、顕著な結果は出ていないが、代わりに硫黄代謝に関する酵素類（シスタチオニン β-シンターゼ（CBS）、シスタチオニン γ- リアーゼ（CSE）、SQOR、CARS）の着床前後期で興味深い結果が得られている。
2. 野生型では卵の培養成績が比較的安定しているICRマウスで8代以上のバッククロスを行い、ICR系xCTKOの造成し、少なくとも培養系では、C57BL6j系と同様な再現性が得られており、この実験モデルの使用が可能である点は確認できている。
3. 付随した成果ではあるが、卵巣組織切片の卵胞を発育ステージ毎に自動計測が可能なAI（人工知能）モデルの構築を試み、二次卵胞以降の計測では、実用的に使用できるモデルを構築できた点は成果があったと認識される。今後の画像解析技術にも、このアプローチの応用が期待できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
原始卵胞は卵巣の皮質縁に位置することから、呼吸量が抑制的かつ代謝を低く抑えることが維持することに重要と考えられる。それらを検証する目的で、硫黄代謝に関する酵素類（シスタチオニン β-シンターゼ（CBS）、シスタチオニン γ- リアーゼ（CSE）、SQOR、CARS）の動態を指標として、解析を進める。また系統造成したICR系xCTKOマウスで調査を行いながら、研究計画の項目１および２の未実施の部分についても進める。さらに、原始卵胞数の維持に関して、ほかの抗酸化機能遺伝子の欠損の影響（ALR欠損またはSOD1欠損マウス）ついても検証し、D11投与マウスとの違いがあるのかについても注視して進める。
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