Ionic regulation of hemolymph in euryhaline crabs: the roles of minor cations

Research Project

Project/Area Number	23K05597
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 42030:Animal life science-related
Research Institution	Suzuka National College of Technology
Principal Investigator	山口雅裕鈴鹿工業高等専門学校, 生物応用化学科, 教授 (00360660)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	豊田賢治金沢大学, 環日本海域環境研究センター, 特任助教 (00757370) 甲斐穂高鈴鹿工業高等専門学校, 生物応用化学科, 准教授 (50518321)
Project Period (FY)	2023-04-01 – 2026-03-31
Project Status	Granted (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥4,290,000 (Direct Cost: ¥3,300,000、Indirect Cost: ¥990,000) Fiscal Year 2025: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000) Fiscal Year 2024: ¥650,000 (Direct Cost: ¥500,000、Indirect Cost: ¥150,000) Fiscal Year 2023: ¥2,730,000 (Direct Cost: ¥2,100,000、Indirect Cost: ¥630,000)
Keywords	体液調節 / 広塩性カニ類 / 遺伝子発現
Outline of Research at the Start	多くの海産無脊椎動物は体液の塩濃度を調節できず、体液と外液（海水）の塩濃度が等しい。しかし、河口域に生息する無脊椎動物には、環境中の塩濃度が低下しても体液塩濃度を高く維持できる種が存在し、特にカニ類でこの能力が発達していることがよく知られている。しかし、この仕組みは明らかではなく、この仕組みの解明は、無脊椎動物の汽水・淡水域への進出を可能としたのかを考えるうえでも重要である。本研究は、「海水中に存在する３種のマイナー陽イオンがエラにおける遺伝子発現を速やかに調節し、これが体液塩濃度の維持に貢献する」という新規仮説に基づき、河口域カニ類の体液塩濃度調節の仕組みについて解明を目指すものである。
Outline of Annual Research Achievements	ヤマトオサガニやアシハラガニなどの広塩性カニ類は、淡水中でも海水中でも生存できるが、海水と同程度の塩濃度の食塩水中では、過度にNa+を取り込み、このため体液イオンバランスが崩れて短時間のうちに斃死する。この過度なNa+の取り込みの原因を明らかにするため、私たちはヤマトオサガニのエラにおいて、食塩水、淡水（低濃度食塩水）、疑似海水の3条件下で発現が変動する遺伝子をRNAseqによって網羅的に解析した。その結果、特に食塩水と疑似海水の比較により、マイナー陽イオンによって発現が調節されると考えられる遺伝子が多数同定された。私たちは当初、疑似海水では発現が低下するが、食塩水中では淡水中と同様に発現が上昇する遺伝子を想定して実験を行っていた。しかし、そのような遺伝子だけでなく、淡水中では発現が低下し、疑似海水中では発現が亢進、食塩水中ではさらに疑似海水中よりも発現が亢進する、という遺伝子が多数同定された。エラでのNa+輸送は、Na+/K+ ATPaseやNa+/H+ exchangerなどによって行われていることが従来から報告されていた。しかし、今回の結果から、従来知られている輸送体だけではなく、Na+と一緒にアミノ酸を共輸送する輸送体など、何種類かの輸送体の発現が食塩水条件下で上昇することが分かり、これらの輸送体がエラにおけるNa+の取り込みを促進すること、これらの遺伝子の過剰発現が食塩水中でNa+を過度に取り込む原因となっていることが示唆された。また、チャネルや輸送体遺伝子の他にも、Na+/K+ ATPaseの発現を促進することが知られているホルモンがエラにおいても食塩水条件下で強く発現誘導されるなど、食塩水中で過度のNa+の取り込みを誘導する原因となる遺伝子の興味深い候補がいくつか同定できた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 研究初年度にあたる2023年度は、過剰なNa+取り込みの原因となる候補遺伝子をRNAseqによって同定することとしていた。おおむねこの目的は果たせたと考えている。特に、当初は各条件下で1個体ずつ解析する予定だったが、3個体ずつ解析できたため、信頼性の高いデータを得ることができた。2024年度以降、これらの遺伝子の発現を抑制して表現型を解析する素地が整ったと考えている。
Strategy for Future Research Activity	得られた候補遺伝子のcDNAを実際にクローニングし、その塩基配列を同定する。それをもとに、各条件下でこれら遺伝子の発現をリアルタイムPCRやin situ hybridizationによって解析する。さらに、得られた配列をもとにRNA干渉のための二本鎖RNAを合成し、これを個体に注入し、食塩水中で飼育し、この時の表現型（生存率・体液Na+濃度、体液浸透圧など）を解析することにより、これらの遺伝子が食塩水中での過度なNa+取り込みの原因遺伝子であるかどうかを突き止める。これ等の結果を総合して、マイナー陽イオンがどの遺伝子の発現を制御し、どのような影響を与えているのかを突き止め、体液調節におけるマイナー陽イオンの役割を明らかにする。