| Project/Area Number |
23K05650
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 43010:Molecular biology-related
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| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
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Principal Investigator |
中村 彰良 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (10583891)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
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| Keywords | 立体構造解析 / tRNA断片 / アミノアシルtRNA合成酵素 / DNA/RNAポリメラーゼ / 核酸 / タンパク質 / 鋳型依存伸長反応 / 逆向き重合 |
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| Outline of Research at the Start |
逆向きの3′-5′方向へ塩基伸長する酵素Thg1は、既存の概念にはない核酸合成手法として注目を浴びている。しかし、Thg1は必須遺伝子であり遺伝学解析が困難であることから、Thg1に現存する3′-5′方向ポリメラーゼ活性の生物学的意義の解明には至っていない。そこで本研究は、 遺伝子重複しかつ機能分化が示唆されている2種類のシロイヌナズナThg1に着目し、近年 Thg1の関与が報告されているtRNA断片による遺伝子発現制御に焦点をあて、構造機能解析、 RNA解析および遺伝学解析を統合することで、3′-5′方向ポリメラーゼが担うtRNA断片を介した遺伝子発現制御メカニズムと生理機能を解明する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
自然界で唯一、逆向きの3′-5′方向へ塩基伸長する酵素Thg1は、既存の概念にはない核酸合成手法として注目を浴びている。我々が世界に先駆けてThg1のRNA複合体の構造解析に成功したことで、3′-5′方向ポリメラーゼ反応機構は解明されつつある。しかし、Thg1はタンパク質合成に必須な遺伝子であり遺伝学解析が困難であることから、なぜThg1には3′-5′方向ポリメラーゼ活性が現存するのか、その生物学的意義の解明には至っていない。そこで本研究は、遺伝子重複しかつ機能分化が示唆されている2種類のシロイヌナズナThg1に着目し(Thg1-1およびThg1-2)、近年Thg1の関与が報告されているtRNA断片による遺伝子発現制御に焦点をあて、構造機能解析、RNA解析および遺伝学解析を統合することで、3′-5′方向ポリメラーゼが担うtRNA断片を介した遺伝子発現制御メカニズムと生理機能を解明する。
今年度はThg1-1およびThg1-2を遺伝子欠損したシロイヌナズナを用いて、Thg1-1欠失体のみが温度感受性を示すことを確認し、RNA-seqおよびsmall RNA-seqにより遺伝子発現とtRNA断片を比較すべくサンプリングを行った。現在RNAライブラリーの作成を行っている。また、AlphaFold2を用いたThg1-1およびThg1-2のtRNA複合体モデルの構造比較を行い、Thg1-1でtRNAと相互作用する可能性がある部位がThg1-2では欠失していることを見出した。この部位が3′-5′方向ポリメラーゼ活性に関与する可能性を考え、現在変異体解析の準備を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度はThg1-1とThg1-2の3′-5′方向ポリメラーゼ活性を比較すべく、シロイヌナズナの各欠損体が異なる表現型を示すことを確認し、RNAサンプルの調製まで完了している。また、AlphaFold2を用いた構造比較から申請時にはなかった視点からThg1-1とThg1-2の違いを見出すことに成功しており、遺伝学的解析と分子生物学的解析の両方から3′-5′方向ポリメラーゼ活性の比較を進めることが出来ている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後はRNA-seqおよびsmall RNA-seq解析を行い、Thg1-1およびThg1-2の遺伝子発現制御の違いを明らかにしていく。また、Thg1-1およびThg1-2の変異体解析も進め、生化学実験およびシロイヌナズナの相補実験等に取り組む。
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