| Project/Area Number |
23K05667
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 43020:Structural biochemistry-related
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
池上 貴久 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 教授 (20283939)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,560,000 (Direct Cost: ¥1,200,000、Indirect Cost: ¥360,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
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| Keywords | NMR / GAPDH / LDH / 解糖系 / ホモ多量体 / 乳酸脱水素酵素 / 乳酸発酵 / Warburg効果 / G-body |
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| Outline of Research at the Start |
グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（GAPDH）は解糖系を触媒する酵素である。その最終産物であるピルビン酸は通常は TCA サイクルに投入されるが、酸欠状態の時は、発酵過程に入って乳酸脱水素酵素（LDH）の触媒を経て乳酸に還元される。GAPDH と LDH とが相互作用することは示唆されてはいるものの、構造的な知見はまったくない。そこで、NMR の手法を駆使してこの複合体構造を決定する。発酵過程は酸欠状態にかかわらず癌細胞でも見られるため（Warburg 効果）、この仕組みの理解にも貢献できると期待している。
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| Outline of Annual Research Achievements |
生物はグルコースを取り込み、解糖系においてピルビン酸にまで代謝する。このピルビン酸はミトコンドリアにまで拡散し、その中でクエン酸回路に入り込む。しかし、急速にエネルギーが必要な際や酸素欠乏時にはピルビン酸は乳酸発酵の経路に入る。解糖系で機能する酵素としてグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（GAPDH）があり、発酵で機能する酵素として乳酸脱水素酵素（LDHA）がある。前者は補酵素として NAD を取り込み NADH を放出する。一方 LDH はその逆である。よって、両者が細胞質内で近くにあれば、補酵素の授受が効率よく行われるはずである。数十年前より、GAPDH と LDH が局在化しているという観察例があるが、in-vitro で実際にこれが観測された例はほとんどなく、相互作用はあっても動的で遷移的であると考えられている。そこで、筆者は NMR を用いてこの相互作用の検出を試みた。まず LDH を 15N, 13C, 2H 標識体として調製すべく、プラスミドを調製し大腸菌にて発現を試みた。その結果、大量の LDHA を発現させることに成功した。しかし、そのうちの９割程が封入体となってしまうため、培養温度を下げるなどさまざまな条件の検討をおこなった。しかし、今のところ大きな改善は得られていない。GAPDH 側を 15N, 13C, 2H で標識し LDHA 側を非標識にて混合し NMR で測定したところ、数個のピークに変化が見られた。しかし、相互作用の面積を考えると摂動を受けたピークの個数が少ないため、これは非特異的相互作用であるとみている。細胞内環境でないと相互作用しないとも示唆されていることから、今後は、細胞内環境を疑似的に作りだす、NAD ・ NADH などを加えたり除いたりするなど、条件を変えて同様の観測を行う予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
おおむね予定通りに進行しているが、LDHA が発現のための大腸菌内において正しく fold すれば、サンプル調製に費やす時間を大幅に節約できるため、より研究を促進できるはずである。また、相互作用の有無については、GAPDH 側を安定同位体で標識するだけでも可能ではあるが、両者の相互作用部位を同定するには、どうしても LDHA 側も標識したい。そのためには、封入体にいく割合をもっと減らす必要がある。Arctic Express などのコンピテントセルの形質転換なども試みたが、今のところ改善策は得られていないが、溶解性を増進させるためのタグ蛋白質（Trigger Factor など）を N 末端側につけることなどを検討している。その場合、LDHA がホモ四量体を組むことを考慮し、四次構造形成に干渉しないようなタグを選ぶ必要がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
GAPDH と LDHA は、in-vitro そのままの状態では相互作用が検出できず、細胞内環境に似た条件、例えばグリセロールやフィコールなどを加えた状況で検出できるとされている（ただし、それはまだ Native-PAGE の結果による Sci. Rep. (2020) 10(1), 10404）。また、補酵素である NAD ・ NADH の有無によっても相互作用の on/off が切り替わる可能性があり、これら補酵素の有無の条件も変える必要がある。以前より GAPDH のメチル基の帰属を進めており、相互作用が NMR で検出されれば、少なくとも GAPDH のどの領域が関与しているかは分かるはずである。同様に LDHA 側のメチル基の帰属も必要である。
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