環状mRNA・リボソーム・腫瘍増殖因子APPLEによる翻訳開始制御の立体構造解析

• Project/Area Number: 23K05674
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 43020:Structural biochemistry-related
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 伊藤 桜子 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 研究員 (60597152)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2025: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000); Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2023: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
• Keywords: 翻訳

Outline of Research at the Start

真核生物のCap依存的翻訳において、mRNA 5′末端に結合するeIF4FとmRNA 3′末端に結合するPABPとの相互作用を介したmRNAの環状化が古くから知られている。mRNA環状化自体の分子機構は詳細に解明されているものの、「環状mRNAとリボソームによる翻訳開始制御」の分子機構は不明である。マイクロペプチドAPPLEは、多種の腫瘍細胞で高発現する腫瘍増殖因子であり、eIF4FとPABPの相互作用を直接的に増強して翻訳開始を促進する。本研究では、APPLEとリボソームを含む翻訳開始複合体の立体構造を解析し、「環状mRNAとリボソームによる翻訳開始制御」の分子機構およびAPPLEの腫瘍増殖機構を明らかにする。

Outline of Annual Research Achievements

真核生物のCap依存的翻訳においては、mRNAが環状化していると考えられている。eIF4FとPABPの相互作用を介してmRNAが環状化する機構については研究が進んでいるが、環状mRNAとリボソームがどのように協同して翻訳開始を制御するかは不明である。
2021年に発見された腫瘍増殖因子であるマイクロペプチドAPPLEは、eIF4FとPABPの相互作用を増強して翻訳開始を促進する。本研究では、APPLEとリボソームを含む翻訳開始複合体の立体構造を解明し、「環状mRNAとリボソームによる翻訳開始制御」の分子機構およびAPPLEの腫瘍増殖機構を明らかにする。
本年はまず、立体構造解析および生化学実験に用いるAPPLEの調製を試みた。大腸菌を用いた発現系によりGST-APPLEを大量発現し、アフィニティカラム、イオン交換カラム、およびゲルろ過カラムを用いてAPPLEの精製を行った。その結果、予想される分子量のAPPLEに加えて、分子量の小さいAPPLEがほぼ等量含まれることから、APPLE内に部分切断を受けやすい配列があることがわかった。
並行して、立体構造解析に適したmRNAを見出す目的で、APPLEの基質であると提唱されているmRNAの一つであるKRASのmRNA配列を用いてレポーターの構築を進めた。KRASの5'UTRおよびコーディング配列に続けてウミシイタケルシフェラーゼを発現するmRNAを構築し、ヒト翻訳因子を用いた試験管内翻訳再構成系に添加したところ、ルシフェラーゼ発光が検出されなかった。そこで、KRAS由来部分の配列検討をし、KRAS コーティング配列を削除して5'UTRの直下にウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を入れた系を構築したが、改善はみられていない。今後は、別の遺伝子を用いてmRNAの調製を進める。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

本研究の遂行に際しては、APPLEおよびAPPLEが翻訳促進する基質mRNAの調製が必須である。まず、APPLEの調製を試みたところ、APPLEの精製に成功したものの、APPLEは部分分解を受けることがわかった。
また、mRNAについては、APPLEの基質であるKRAS遺伝子を用いて検討を進めた。ところが、現在のところ、ヒト翻訳因子を用いた試験管内再構成系でKRAS 5'UTR下流に組み込んだルシフェラーゼの発現がみられない。

Strategy for Future Research Activity

APPLEが部分切断されていることが明らかになったので、質量分析やN末端分析により切断部位を決定するなどの方法で、均一なAPPLEの調製を試みる。並行して、APPLEとeIF4E、eF4G、PABPとの結合も試験管内で確認したい。
基質であるmRNAについて、立体構造解析に適したmRNAを見出すために、ルシフェラーゼを用いたレポーター系を用いた。ところが、KRAS遺伝子の5'UTRの下流にKRASのコーディング配列とルシフェラーゼを発現する系を構築し、試験管内再構成系に加えたところ、ルシフェラーゼの発現が見られなかった。今後はまず、KRAS自体の発現をウェスタンブロッティングなどで確認し、このmRNAを鋳型にした翻訳が行われているかを確認する。さらに、他の基質mRNA配列を用いるなどの方法で検討を進める。