| Project/Area Number |
23K05682
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 43030:Functional biochemistry-related
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| Research Institution | Akita Prefectural University |
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Principal Investigator |
鈴木 龍一郎 秋田県立大学, 生物資源科学部, 准教授 (70632397)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2027-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2026: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,300,000 (Direct Cost: ¥1,000,000、Indirect Cost: ¥300,000)
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| Keywords | 酵素学 / 多糖代謝関連酵素 / 多糖の生産 / 構造生物学 |
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| Outline of Research at the Start |
シアノバクテリアは光合成原核生物であり、光合成産物として一般にグリコーゲンを生産するが、澱粉を生産する種もごくわずかに見出されている。シアノバクテリアの澱粉生合成系はシンプルであり、研究と応用に適している。澱粉の構造は食味・物性に影響を与えるため、構造を制御すれば用途に適した構造の澱粉を供給できるが、構造を制御する仕組みは未解明であった。本研究では、シアノバクテリア澱粉の生合成系で働くグリコーゲンシンターゼの構造機能解析を行い、役割を解明することで、シアノバクテリアが持つシンプルな澱粉生合成系（澱粉構造を制御する仕組み）のモデル作成を試みる。また、澱粉の酵素合成の基盤技術確立を目指す。
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、シアノバクテリア澱粉の構造を制御する仕組みの解明を目的とし、シアノバクテリア澱粉の代謝に関わるグリコーゲンシンターゼ（ＧＳ）に焦点を絞り、大腸菌内での発現系構築と機能解析を行った。５１１４２株由来ＧＳ１およびＧＳ２については、本研究開始時点で大腸菌内での発現系を用いた精製酵素調製法をすでに確立していたため、令和５年度はこれら酵素の基本的な性質（比活性、基質特異性、反応産物特異性）を解析した。これら酵素の市販のカキグリコーゲン（ＯＧＧ）およびポテトアミロペクチン（ＰＡＰ）に対する比活性を求めたところ、ＧＳ１およびＧＳ２は、それぞれＰＡＰおよびＯＧＧを好んでいた。また、マルトオリゴ糖を基質とした場合、ＧＳ１は重合度（ＤＰ）２以上を基質としてグルコース（Ｇｌｃ）２残基分を伸長したが、ＧＳ２はＤＰ３以上を基質としてＧｌｃ６残基分を伸長することを明らかにした。これらのことから、ＧＳ１およびＧＳ２の基質特異性と反応産物特異性は異なり、それぞれ短鎖および長鎖の伸長に関わることが示された。ただし、これら酵素の酵素学的解析は可能であったが、発現量と溶解度が低いため結晶化には適していなかった。結晶化を目指すため、８８０２株、１０２７５６株、７４２４株、６８０３株、および７９４２株由来ＧＳ遺伝子を、ｐＥＴ１５ｂおよびｐＣｏｌｄＩに連結したコンストラクトを構築し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株内で発現させた。しかし、いずれのコンストラクトを用いた場合についても封入体となってしまい、可溶性画分にリコンビナント酵素は得られなかった。なお、令和５年度にＧＳではないが別のシアノバクテリア澱粉代謝酵素について、変性剤で可溶化させた後にリフォールディングさせる方法（巻き戻し法）が適用可能であることを見出した。巻き戻し法を用いた精製リコンビナント酵素の調製について、「今後の研究の推進方策」に記載した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
複数のＧＳオルソログの大腸菌内での発現系構築および特性解析を目指し、８８０２株、１０２７５６株、７４２４株、６８０３株、および７９４２株由来ＧＳ遺伝子の大腸菌内での発現系を構築したが、いずれも封入体となってしまい、５１１４２株由来ＧＳ１およびＧＳ２の基本的性質のみの解析に留まった。
結晶化については未着手であり、計画通りに進まなかった。また、成果が未発表であるため、「やや遅れている」と判断した。次年度は遅れを取り戻し、成果を発表していくように努力をしたい。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続きＧＳの結晶構造解析および詳細な特性解析を目指し、グリコーゲン生産性および澱粉生産性シアノバクテリア由来のＧＳを用いた研究を推進する。次年度以降は、以下の１～５の実験を行う。
１．５１１４２株由来ＧＳ１およびＧＳ２について、詳細な特性解析（反応速度論的解析、多糖との結合解析など）を行う。
２．これまでにクローン化した８８０２株、１０２７５６株、７４２４株、６８０３株、および７９４２株由来ＧＳ遺伝子について、可溶化リコンビナント酵素の獲得を目指して、プラスミド（ｐＣｏｌｄＰｒｏＳ２）および大腸菌株（Ｃ４１ （ＤＥ３）、Ｃ４３ （ＤＥ３）、ＳｏｌｕＢＬ２１など）を用いた発現を試す。
３．ＣＬｇ１株および１０６０５株由来ＧＳ遺伝子についても、ｐＣｏｌｄＩおよびｐＣｏｌｄＰｒｏＳ２プラスミドにクローン化し、上記２．の大腸菌株を用いて発現させる。
４．上記２．の条件で発現させても封入体となってしまった場合は、巻き戻し法を試す。また、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびプラスミド（ｐＹＥＳ２）を用いた発現系も構築し、結晶化に適した精製リコンビナント酵素の獲得に務める。
５．５１１４２株および７９４２株由来ＧＳ遺伝子の細胞内での多糖代謝における役割を知るため、これら遺伝子の発現解析を行う。
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