Development of yeast protein expression library expressing all Arabidopsis membrane transporters

• Project/Area Number: 23K05696
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 43030:Functional biochemistry-related
• Research Institution: Shimane University
• Principal Investigator: 秋廣 高志 島根大学, 学術研究院農生命科学系, 助教 (40508941)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000); Fiscal Year 2025: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000); Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000); Fiscal Year 2023: ¥2,600,000 (Direct Cost: ¥2,000,000、Indirect Cost: ¥600,000)
• Keywords: 膜輸送体 / チャンネル / 酵母タンパク質発現ライブラリー / シロイヌナズナ / トランスポーター / 膜タンパク質

Outline of Research at the Start

植物における物質の移動や蓄積を理解する上で、膜輸送体の機能解析を進めることは重要である。本研究では、膜輸送体の機能解析を行うための、新たなスクリーニング法を開発することを目的とし、シロイヌナズナの膜輸送体を全て発現する究極の酵母タンパク質発現ライブラリーの構築を目指す。従来の膜輸送体研究は、『時間をかけて変異体を選抜し、その原因遺伝子を解析する方法』で行われてきた。本研究では、『膜輸送体を全て発現する酵母タンパク質発現ライブラリーを使って、目的とする物質を輸送する活性を持つ膜輸送体を、網羅的かつ短期間で選抜するという、従来とは逆の手順のスクリーニング法の開発を目指す。

Outline of Annual Research Achievements

シロイヌナズナの膜輸送体をコードする遺伝子は約1300ある。それらをすべて出芽酵母において発現させるライブラリーの構築を行っている。本年度は、完全長cDNAとして理研バイオリソースに収蔵されている約600を入手し、これらをPCRにて増幅し、酵母タンパク質発現ベクターであるpYES2にサブクローニングした後、シーケンスを確認する作業を行った。研究を開始した直後に、Sliceという新たなクローニング法が開発されたことから、Sliceを用いてサブクローニングを行ったところ、工程が大凡半分に減った。現在までに約500の遺伝子をサブクローニングすることに成功した。完全長cDNAは全部で約600あるので、80%くらいをクローニングすることができた。今後は、RT-PCRで遺伝子を獲得する予定であるが、ｍRNAの抽出を完了させている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

完全長cDNAの入手に200万円以上かかってしまったため、その他の実験に使える予算が不足してしまったため、若干実験に遅延が生じた。

Strategy for Future Research Activity

今後は、完全長cDNAが存在しない遺伝子をRT-PCRで増幅してサブクローニングする予定である。RT-PCRに用いるRNAをRNA-seqすることで、発現している遺伝子を特定したうえで、RT-PCRを行う事で、効率的に目的とする遺伝子をクローニングしようと考えている。