Detection of functional stator rotation of the bacterial flagellar motor

• Project/Area Number: 23K05701
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 43030:Functional biochemistry-related
• Research Institution: Hosei University
• Principal Investigator: 曽和 義幸 法政大学, 生命科学部, 教授 (10519440)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2026-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2025: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2024: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000); Fiscal Year 2023: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
• Keywords: べん毛モーター / 回転分子機械 / 固定子

Outline of Research at the Start

大腸菌べん毛モーターは，エネルギー源であるイオンの流れを回転に変換する分子機械である．人工のモーターと同様に回転子と固定子から構成される．近年，モーターを構成する分子の原子レベルの構造をもとに，固定子が分子内で回転し，まさに歯車のように回転子を回転させるモデルが提唱された．このモデルでは，べん毛モーターの特徴の1つである回転スイッチ機構も説明ができる．本研究では，この「固定子分子内回転モデル」の検証をおこなう．

Outline of Annual Research Achievements

大腸菌べん毛モーターは回転する分子機械であり，固定子MotA/MotB複合体の細胞質ドメインと回転子リングが相互作用し，細胞膜を通過するイオンの流れをエネルギー源として回転トルクを生み出す．近年，モーター固定子の原子構造をもとに，イオン透過にともなう「固定子分子内回転」が回転子リングと連動して，モーター全体の回転を生み出すモデルが提唱された．本研究では，この固定子分子内回転が実際にモーター回転時に起こっているのかを検証することを目的としている．
2023年度は，蛍光観察による直接検出の準備および近年固定子の機能調節に関わるとされるFliLについて研究をおこなった．まず，蛍光観察のための準備として固定子を近年報告され非常に蛍光強度および安定性が高いとされるmStayGold等で標識を試みた．固定子の機能を保持させるため，多数のリンカーなども検討した．また，FliLが固定子に結合して機能すること，およびその個数を特定するためにGFP-FliLの動態を観察した．その結果，今後さらに詳細な解析は必要であるものの，過去に構造解析から予想されるストイキオメトリーと近い値が得られた．さらに，固定子を蛍光タンパク質ではない蛍光色素で標識する準備としてテトラシステインタグを用いた．FliLにテトラシステインタグを複数箇所に導入することを試み，機能を保持する変異体を複数得ることができた．FlAsHまたはReAsHで染色したころ，固定子-FliL複合体を標識した輝点とみられるものも観察されたが，観察用の株の作成など系の改善に取り組んでいる．

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

複数の手法でべん毛モーター内の回転を検出する試みを進めており，それぞれ解決するべき問題点が明らかになってきているため．

Strategy for Future Research Activity

調節因子も含んだ固定子複合体の蛍光観察と光架橋技術を組み合わせることで，引き続き観察系の改善に取り組む．

Research Products

• [Int'l Joint Research] UNSW(オーストラリア)
• [Journal Article] Flagellar polymorphism-dependent bacterial swimming motility in a structured environment (2023)
  • Author(s): Yoshiaki Kinosita, Yoshiyuki Sowa
  • Journal Title: Biophysics and Physicobiology Volume: 20 Issue: 2 Pages: n/a
  • DOI: 10.2142/biophysico.bppb-v20.0024
  • ISSN: 2189-4779
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Presentation] 大腸菌センサーキナーゼBaeSから走化性制御因子CheYへのクロストーク (2024)
  • Author(s): 武井 陸，井芹 友香，大森 楓河，田島 寛隆，石黒 亮，日高 直樹，吉村 美歩，曽和 義幸，西川 正俊，山本 兼由，川岸 郁朗
  • Organizer: 2023年度べん毛研究交流会
• [Presentation] 細菌べん毛モーター制御因子FliLの固定子との相互作用の解析 (2024)
  • Author(s): 熊谷 桃花，石田 翼，日髙 直樹，曽和 義幸
  • Organizer: 2023年度べん毛研究交流会
• [Presentation] Stator dynamics of chimeric Na+-driven E. coli flagellar motor observed with fluorescent microscopy (2023)
  • Author(s): Tomoya Shoji, Naoki Hidaka, Yong-Suk Che, Yoshiyuki Sowa
  • Organizer: 第61回日本生物物理学会年会
• [Presentation] The L118P mutation in the stator protein MotB affects motor adaptation to load in the bacterial flagellar motor (2023)
  • Author(s): Shuo Peng Wang, Tsubasa Ishida, Naoki Hidaka, Shoichi Toyabe, Seiji Kojima, Yoshiyuki Sowa
  • Organizer: 第61回日本生物物理学会年会
• [Presentation] Heterotrimer formation of MdtB and MdtC, inner membrane transporters of the RND-type xenobiotic efflux complex (2023)
  • Author(s): Yuto Nakamura, Kenichiro Kashihara, Hirotaka Tajima, Yoshiyuki Sowa & Ikuro Kawagishi
  • Organizer: 第61回日本生物物理学会年会
• [Presentation] Development of an optical method to control bacterial motility using light-driven proton pumping rhodopsins (2023)
  • Author(s): Kotaro Nakanishi, Keiichi Kojima, Yoshiyuki Sowa, Yuki Sudo
  • Organizer: 第61回日本生物物理学会年会