| Project/Area Number |
23K05711
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 43040:Biophysics-related
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| Research Institution | Tokyo Gakugei University |
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Principal Investigator |
飯田 秀利 東京学芸大学, 教育学部, 名誉教授 (70124435)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2027-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2023)
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| Budget Amount *help |
¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000)
Fiscal Year 2026: ¥910,000 (Direct Cost: ¥700,000、Indirect Cost: ¥210,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,430,000 (Direct Cost: ¥1,100,000、Indirect Cost: ¥330,000)
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| Keywords | 機械受容チャネル / 立体構造 / 電気生理学的性質 / Cryo電顕 / カルシウム / 電気生理学 / クライオ電子顕微鏡 |
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| Outline of Research at the Start |
シロイヌナズナのカルシウム透過性機械受容チャネル（以下MCA)の電気生理学的性質と３次元構造を明らかにする。そのために、以下の手順で研究を進める。１）全長のMCAタンパク質のin vitroでのタンパク質の合成と精製の実験系を確立する。２）精製した全長のMCAタンパク質をリポソームに組み込み、パッチクランプ法でMCAチャネルの電気生理学的性質を明らかにする。３）精製した全長のMCAタンパク質をクライオ電子顕微鏡で顕微鏡像を多数取得し、単粒子解析によりその三次元構造を書きらかにする。また、分子動力学的シュミレーションを行い、開口状態と閉鎖状態の構造を予測する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
接触、重力、浸透圧などの機械刺激は植物の発生と成長の制御に重要である。これらの機械刺激を受容して細胞内にイオンシグナルを発生させるのが機械受容チャネル（MSチャネル）である。近年動物のMSチャネルの構造と電気生理学的性質が解明され、2021年のノーベル生理学医学賞の対象にもなった。
一方、機械刺激が植物の発生・成長と環境応答に重要であることは、1880年代にチャールズ・ダーウィンによって示されていたが、その後の分子レベルでの解析は大きく遅れた。
そこで、本研究計画では「陸上植物に固有のカルシウム透過性機械受容チャネルの電気生理学的性質と立体構造」をメインテーマとする。このテーマに即した研究を行う目的で、シロイヌナズナのカルシウム透過性MSチャネルのタンパク質であるMCA1とMCA2の精製を試みている。具体的には、MCAタンパク質のin vitro合成用のプラスミドを作った。この時、ベクターはセルフリーサイエンス社のpEU-E01-MCSを使い、C末端を削ったMCA2タンパク質であるMCA2(1-173)の両端に、精製の際に用いるHisタグと５つのFLAGタグを付けタグを付けた。こうして作製したのが、pEU-E01-6HMCA2(1-173)FLおよびpEU-E01-FLMCA2(1-173)6Hである。現在、これを使ってタンパク質をin vitro合成と精製の条件を検討しているところである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
In vitroでのMCA1とMCA2タンパク質の合成精製が難航している。少量の生産ならば問題ないのだが、Cryo電子顕微鏡解析に供するほどの大量のタンパク質の調製が難しい。
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| Strategy for Future Research Activity |
上記の困難を克服するために、in vitro合成ではなく、昆虫細胞などを使ったin vivo 合成法も検討している。
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