哺乳動物ミトコンドリアFoF1ATP合成酵素高次集合体の構造解析

• Project/Area Number: 23K05716
• Research Category: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• Allocation Type: Multi-year Fund
• Section: 一般
• Review Section: Basic Section 43040:Biophysics-related
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 慈幸 千真理 京都大学, 複合原子力科学研究所, 准教授 (70585976)
• Project Period (FY): 2023-04-01 – 2028-03-31
• Project Status: Granted (Fiscal Year 2023)
• Budget Amount: ¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000); Fiscal Year 2027: ¥260,000 (Direct Cost: ¥200,000、Indirect Cost: ¥60,000); Fiscal Year 2026: ¥520,000 (Direct Cost: ¥400,000、Indirect Cost: ¥120,000); Fiscal Year 2025: ¥520,000 (Direct Cost: ¥400,000、Indirect Cost: ¥120,000); Fiscal Year 2024: ¥520,000 (Direct Cost: ¥400,000、Indirect Cost: ¥120,000); Fiscal Year 2023: ¥2,860,000 (Direct Cost: ¥2,200,000、Indirect Cost: ¥660,000)
• Keywords: ATP合成酵素 / ミトコンドリア / オリゴマー

Outline of Research at the Start

本研究では、哺乳動物ミトコンドリアFoF1ATP合成酵素を研究対象とする。本酵素の機能異常は、ミトコンドリア病等を引きおこすことより、精緻な立体構造の解明は今後の薬剤分子設計における重要な基盤となると考えられる。本酵素は、非常に不安定で調製困難なため、半世紀に及ぶ構造学研究によっても、その全体構造が明らかにされていない。また本酵素は、高次集合体（オリゴマー）を形成して働く酵素であるが、その形成メカニズムについてもわかっていない。本研究ではクライオ単粒子構造解析とX線結晶構造解析によって、原子構造と高次の形態変化の両面を追求し、本酵素のミトコンドリア機能に関わる仕組みを解明する。

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、クライオ電子顕微鏡による単粒子構造解析とX線結晶構造解析によって原子レベルの構造と高次の形態変化の両面を追求して、哺乳動物FoF1ATP合成酵素のミトコンドリア機能への関わる仕組みの解明を目的とする。
構造生物学においては、解析技術が発達してきているものの、原子レベルでの構造解析のためには、安定で単分散性の高い状態の大量の試料を必要とする。本酵素は、回転を伴い柔軟な構造をとるため非常に不安定で、精製が極めて困難なため、５０年以上にわたって精製が実現していなかった。そこで、我々は研究進展の鍵を握る試料調製法に重点を置いて取り組んできた結果、牛心筋由来モノマー、ダイマー、テトラマー、オリゴマーをそれぞれ大量に無傷な状態で精製することに成功した(Jiko et al., JBC, 2024)。 また創薬研究をも視野に入れたクライオ電顕による高分解構造解析を開始し、多くの問題を解決して、サブユニットを解離することなく安定に溶液を交換する条件を確立する方法を開発した。現在、内在性阻害蛋白質IF1が結合した本酵素テトラマー分解能は部分的に3.6Aまで、モノマーは、部分的に2.2Aまで到達した。
またダイマーが列に連なったオリゴマーの形成は哺乳動物ミトコンドリアFoF1ATP合成酵素の特徴である。本酵素の高次集合体は、エネルギー産生効率を上げるためと、ミトコンドリア内膜に存在するmitochondrial contact site (MICOS) 複合体と連動したクリステ先端の湾曲部分の形成に重要で、オリゴマー形成の乱れは、いくつかの病態を引き起こすことが報告されている。近年、MICOS複合体の構成分子であるMIC10と本酵素が結合することがわかってきたため、我々が精製した試料において精製オリゴマーにMIC10が結合した状態を確認できる可能性があり鋭意調査中である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

哺乳動物FoF1ATP合成酵素クライオ電顕による構造解析が順調に進んでいる。

Strategy for Future Research Activity

研究の成功の鍵は、安定で無傷なFoF1ATP合成酵素を大量に精製することであり、申請者は、牛心筋由来モノマー、ダイマー、テトラマー、オリゴマーをそれぞれ大量に複合体を維持したまま精製することに成功した。
今後は、ウシ心筋細胞だけでなく、ヒト培養細胞から本酵素テトラマーを精製する方法の確立と、高分解能構造解析を目指す。
生体膜内で本酵素はオリゴマーを形成する際、機能する最小単位はテトラマーであると考えられているため、テトラマーの構造解析は機能解明や創薬開発のために非常に価値がある。本酵素は健康と疾病に深く関与し、ヒト酵素の高分解能構造解析は、本酵素が引き起こす疾患のメカニズムの解明に直接的に生かされると考えられるからである。
また本研究により明らかにしたい学術的な問いは、なぜ哺乳動物ミトコンドリアFoF1ATP合成酵素はオリゴマーを形成するのかである。精製方法を確立することのできた牛心筋由来のモノマー、テトラマーを使った高分解能構造解析に加えて、中性子溶液散乱法等を用いて動態を解析し、オリゴマー形成メカニズムを解明する。

Research Products

• [Journal Article] Large-scale column-free purification of bovine F-ATP synthase. (2024)
  • Author(s): Chimari Jiko , Yukio Morimoto , Tomitake Tsukihara , Christoph Gerle
  • Journal Title: The Journal of biological chemistry Volume: 300 Issue: 2 Pages: 105603-105603
  • DOI: 10.1016/j.jbc.2023.105603
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Inhibition of ATP-synthase reverse-activity restores energy homeostasis in mitochondrial pathologies. (2023)
  • Author(s): Perez, R., Beninca, C., Fernandez del Rio, L., Baghdasarian, C. Shu S., Zanette, V., Gerle, C., Jiko, C., Khairallah, R., Khan, S., Pacheco, D. R. F., Shabane, B., Erion, K., Masand, R.,S. Dugar, S., Ghenoiu, C., Schreiner, G., Stiles, L., Liesa, M., Shirihai, O.S.
  • Journal Title: EMBO Journal Volume: e111699 Issue: 10
  • DOI: 10.15252/embj.2022111699
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Journal Article] Rapid and Highly Stable Membrane Reconstitution by LAiR Enables the Study of Physiological Integral Membrane Protein Functions. (2023)
  • Author(s): Hernandez, A., Asseri, A.H., Purugganan, A.J., Jiko, C., deRam, C., Lill, H., Pabst, M., Mitsuoka, K., Gerle, C., Bald, D., McMillan,D.G.G.
  • Journal Title: ACS Central Science Volume: 9 Issue: 3 Pages: 494-507
  • DOI: 10.1021/acscentsci.2c01170
  • Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
• [Patent(Industrial Property Rights)] FoF1-ATP SYNTHASE OLIGOMER (2024)
  • Inventor(s): 慈幸千真理 森本幸生 クリストフゲーレ
  • Industrial Property Rights Holder: 慈幸千真理 森本幸生 クリストフゲーレ
  • Industrial Property Rights Type: 特許
  • Filing Date: 2024
  • Overseas