Toward reconstitution of in vitro translation system from gene expression

Research Project

Project/Area Number	23K05733
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
Allocation Type	Multi-year Fund
Section	一般
Review Section	Basic Section 43050:Genome biology-related
Research Institution	Rikkyo University
Principal Investigator	鈴木祥太立教大学, 理学部, 助教 (00792714)
Project Period (FY)	2023-04-01 – 2024-03-31
Project Status	Discontinued (Fiscal Year 2023)
Budget Amount *help	¥4,680,000 (Direct Cost: ¥3,600,000、Indirect Cost: ¥1,080,000) Fiscal Year 2025: ¥1,170,000 (Direct Cost: ¥900,000、Indirect Cost: ¥270,000) Fiscal Year 2024: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000) Fiscal Year 2023: ¥1,690,000 (Direct Cost: ¥1,300,000、Indirect Cost: ¥390,000)
Keywords	リボソーム再構成 / 転写翻訳再構成 / 翻訳 / リボソーム / 翻訳因子 / 大腸菌 / Cell-free
Outline of Research at the Start	これまでに大腸菌ゲノムに散在する翻訳因子をセルフリーDNA連結・長鎖DNA増幅技術により集約してまとめた翻訳ユニットDNAを作製している。本研究は無細胞タンパク質合成系により翻訳ユニットDNAの翻訳因子を遺伝子発現させて翻訳系を起動するための至適反応条件および追加の因子を精査し、細胞内の翻訳の振る舞いの再現を目指す。さらにセルフリー長鎖DNA増幅系を共役させることで翻訳ユニットDNAの増幅を伴った翻訳系の自己増幅を図りセントラルドグマの再現に迫る。
Outline of Annual Research Achievements	生命のセントラルドグマの最終ステップであるタンパク質生合成過程「翻訳」は、未だリボソーム形成を含めた形で完全な試験管内の再構成はできていない。大腸菌のリボソームは3種のrRNAを基本骨格として約50種のリボソームタンパク質が協調的に結合して組み上げられる。この過程はリボソームタンパク質のみでなく多くの成熟化因子が関与することが報告されている。しかしながら、実質的なリボソームの形成に関与する最小構成因子を明らかにするためにはボトムアップでリボソームを再構成する必要がある。これまでに所属研究室で開発されたセルフリーDNA連結・長鎖DNA増幅法を用いて、大腸菌ゲノムに散在する54種のリボソームタンパク質とrRNAを一つの環状DNAに集約したリボソームユニットDNAを作製している。このDNAにコードされたリボソーム因子はセルフリー転写・翻訳系により発現することができ、新規合成されたリボソームは薬剤耐性と特定遺伝子のみを認識してタンパク質合成する特徴を持たせることで野生型リボソームと区別できる。本年度はセルフリー転写・翻訳系であるPURE systemを使い、リボソームユニットDNAからリボソームを起動する検討を進めた。まず新規合成されたリボソームを検出するレポーター系の作製と改良を行い、並行してリボソームの成熟化因子17種およびrRNA修飾因子28種をそれぞれコードするDNAライブラリーを作製した。これらを用いて新規合成されたリボソーム活性の検出を試みたが特異的なレポーター活性は検出できていない。本研究では、発現する遺伝子数および複合体を構成する因子数が多いことから、液-液相分離または油中水滴型エマルションを利用した反応場の区画化による反応効率化の必要性が浮上した。