| Project/Area Number |
23K05793
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
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| Allocation Type | Multi-year Fund |
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| Section | 一般 |
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| Review Section |
Basic Section 44020:Developmental biology-related
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| Research Institution | Kochi University |
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Principal Investigator |
藤原 滋樹 高知大学, 教育研究部自然科学系理工学部門, 教授 (40229068)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Project Status |
Granted (Fiscal Year 2024)
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| Budget Amount *help |
¥4,810,000 (Direct Cost: ¥3,700,000、Indirect Cost: ¥1,110,000)
Fiscal Year 2025: ¥1,040,000 (Direct Cost: ¥800,000、Indirect Cost: ¥240,000)
Fiscal Year 2024: ¥1,820,000 (Direct Cost: ¥1,400,000、Indirect Cost: ¥420,000)
Fiscal Year 2023: ¥1,950,000 (Direct Cost: ¥1,500,000、Indirect Cost: ¥450,000)
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| Keywords | ホヤ / 細胞周期 / 遺伝子発現 / Myc / Cdk阻害因子 / DNA複製 / 細胞分化 / ヒストン修飾 / 転写調節 |
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| Outline of Research at the Start |
ホヤ胚の細胞は厳密に決まった回数の分裂の後に分化する。胚の発生初期にDNA複製を阻害するといつまで待っても遺伝子が発現しない。DNA複製回数をかぞえるしくみとしてヒストン修飾が考えられるが，その分子機構は不明である。本研究ではDNA複製阻害や，原がん遺伝子Mycの強制発現，Cdk阻害因子の機能阻害などにより細胞周期の回数を人為的に操作し，遺伝子発現開始のタイミングに及ぼす影響を調べる。また実験胚におけるヒストン修飾の変化を調べる。ヒストン修飾を人為的に操作して遺伝子発現開始のタイミングの変化を調べる。これらの実験により，細胞周期の進行に合わせて適切な時期に遺伝子発現が開始するしくみを解明する。
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| Outline of Annual Research Achievements |
脊索動物ホヤの胚の細胞は，正確に決まった回数の分裂の後に分化する。胚の遺伝子の発現開始には一定回数の DNA 複製が必要であり，発生初期に DNA 複製を阻害すると，いつまで待っても遺伝子は発現しない。
初年度は，筋肉や脊索の前駆細胞で Myc を強制発現させることによって，本来なら細胞周期を離脱する時期になっても DNA 複製を続けていることを明らかにした。また，Cdk 阻害因子（Cdkn1.b）を予定より早く発現させると予定より早く細胞分裂が止まり，脊索の細胞数が減ることを明らかにした。
今年度は，CRISPR/Cas9 等の方法で Cdkn1.b を阻害したとき，脊索細胞の数が増えることを明らかにした。Myc が Cdkn1.b の発現を抑制しているために，Myc の強制発現と Cdkn1.b の阻害が同様の結果になったかも知れないと考え，Myc を強制発現させた胚における Cdkn1.b mRNA の発現と，Cdkn1.b レポーター遺伝子の発現を観察した。その結果，Myc を強制発現させても Cdkn1.b の発現は影響を受けないことがわかった。このことは，正常胚において Myc の発現抑制と Cdkn1.b の発現が独立に起こる現象であることがわかり，この両方がともに起こることによって厳密な細胞分裂回数の制御ができているのではないかと思われた。ここまでの内容を学術誌に投稿すべく，現在論文を執筆中である。
本研究では，研究開始後に方針転換をして，堀江健生教授（大阪大学）の研究室と共同で一細胞マルチオーム解析（scATAC-seq ＋ scRNA-seq）を行うことになった。初年度から卵割期の胚から高収率で核を単離する方法の開発を試みてきたが，今年度，単離核の収率と品質が大幅に改善したので，次年度（最終年度）の早い段階で，マルチオーム解析を行う計画である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
筋肉や脊索などで Myc を強制発現させると，予定よりもたくさん分裂したと思われる細胞が見られ，それらの細胞で DNA 複製が続いていることがわかったが，初年度の研究では，それらの組織でドミナントネガティブ型 Myc（dnMyc）を発現させても細胞分裂回数に影響が出なかった。そこで本年度は dnMyc を発現する細胞が細胞周期を早期に離脱する証拠を掴むべく実験を試みてきたが，今のところ期待した結果は得られていない。最近，私たちの研究室において，エレクトロポレーションによって受精卵にタンパク質を導入する方法を開発したので，その方法で（あるいは顕微注入法で） dnMyc タンパク質を注入して，筋肉系統や脊索系統の割球の細胞分裂に母性 Myc が必要であるかどうか確かめる予定である。
初年度には，核局在シグナルを付加した Cdkn1.b が細胞周期を進行させ，核外搬出シグナルを付加した Cdkn1.b が脊索細胞の収斂伸長を乱すことが示唆された。しかし，タグを付けたり EGFP 融合タンパク質として発現させた Cdk 阻害因子の発現を検出できなかった。タグの種類や位置を変えて，強制発現させた Cdkn1.b を検出する計画であったが，今年度も検出できなかった。次年度には，Cdkn1.b の局在と役割を明確にしたい。
申請書の研究計画においては胚性ゲノム活性化（ZGA）の仕組みの解明にも言及したが，これまでに胚において最初に発現する遺伝子 Foxa.a のレポーター遺伝子を多数試して，ZGA が起こる 8 細胞期に活性化する調節領域が上流 2.6 kb 以内に存在することがわかってきたが，何がその調節領域を活性化しているかは不明である。現在，さらに細かく切り刻んだ調節領域を用いて，ZGA における転写活性化に必要な領域を絞り込む実験を行なっている。
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| Strategy for Future Research Activity |
Myc の機能解析については，論文投稿の準備中であるが，母性 Myc の機能阻害に成功していないので，次年度は dnMyc タンパク質を受精卵に導入する実験を行う。また，強制発現させたタグ付きの Cdkn1.b を免疫組織化学で検出することにはなかなか成功していないが，タグの位置や種類を変えて，次年度には確実に検出する。それによって，核内の Cdkn1.b と細胞質中の Cdkn1.b の役割の違いを明らかにしたい。
今年度，核の単離に成功したら大阪大学との共同研究で一細胞マルチオーム解析を実施する予定であった。しかし，今年度は品質のよい核を効率よく単離する方法を確立するには至らなかった。それに加えて，突然のやむを得ない事情で，共同研究相手の大阪大学の研究室が閉じてしまった。マルチオーム解析を共同で行うことになっていた当該研究室の特任助教・小林健司博士が次年度京都大学の佐藤ゆたか研究室に所属してマルチオーム解析を京都で実施できることになりそうである。本年度末が近づいて，単離核の品質も効率も格段に向上したので，次年度には確実に解析を実施する計画である。
ZGA の仕組みを解明するため，ZGA において最初に活性化する遺伝子 Foxa.a のレポーター遺伝子を作製したが，最終年度にはこれの調節領域を活性化する転写調節因子を明らかにする。特に，過去の研究で ZGA のタイミングを制御すると指摘されていたサイクリン B3 が Foxa.a の調節領域にどのように影響を及ぼすか，また DNA 複製が ZGA のタイミングを決めているかどうかも次年度には解明したい。
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